可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase, sEH）抑制通过增强内皮-间质Notch信号调控Septoclast活性促进长骨生长与骨折愈合

《Cell Proliferation》：Soluble Epoxide Hydrolase Inhibition Regulates Septoclast Activity to Promote Long Bone Growth and Fracture Healing by Enhancing Endothelial-to-Mesenchymal Notch Signalling

　　

摘要：软骨内成骨（endochondral ossification）是附肢骨发育、生理性骨重建及骨折愈合的关键过程。近期研究鉴定间充质基质细胞来源的FABP5+septoclast（SCs）是长骨生长与修复的重要介质，可通过分泌基质金属蛋白酶降解软骨基质并参与生长板重塑。研究人员既往研究表明sEH抑制剂TPPU（1-trifluoromethoxyphenyl-3-(1-propionylpiperidin-4-yl) urea）通过增强H型血管偶联成骨促进长骨生长与骨修复，但TPPU是否通过调控SC活性促进长骨生长与骨折愈合尚不清楚。本研究体内外实验显示，TPPU处理可促进新生小鼠长骨生长，调控生长板肥大软骨细胞（hypertrophic chondrocyte, HC）层，降低HC与增殖软骨细胞（proliferative chondrocyte, PC）宽度比值；同时增强SC活性，表现为生长板邻近干骺端FABP5与MMP9表达升高，并在人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）与人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells, hDPSCs）共培养体系中诱导FABP5+SC样细胞降解软骨细胞。机制上，TPPU上调HUVECs中HIF-1α表达，增强HUVECs与hDPSCs互作并激活hDPSCs中NOTCH信号通路。此外，TPPU通过在骨折部位诱导更多FABP5+SCs及MMP9分泌促进骨折愈合。上述发现提示sEH是通过诱导SC活性调控软骨内成骨的有前景治疗靶点，为骨发育与修复提供新思路。

研究背景与立项依据

长骨的生长发育及骨折修复主要依赖软骨内成骨（endochondral ossification），该过程要求生长板处肥大软骨细胞（hypertrophic chondrocytes, HC）残基被及时清除，血管侵入并招募成骨前体细胞。传统观点认为破骨细胞（osteoclasts）负责软骨吸收，但近年研究鉴定出一种定位于软骨–骨交界（cartilage–osseous junction, COJ）的FABP5⁺septoclast（SCs），属间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）来源，通过分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs，如MMP9、MMP13）降解软骨基质并促进血管侵入。Notch信号是内皮细胞（endothelial cells, ECs）与MSCs/SCs互作的关键通路，ECs高表达Notch配体DLL4，SCs高表达Notch受体（NOTCH1/Notch4）及靶基因Hey1/Heyl，DLL4?Notch互作可上调SCs中FABP5与MMP9。可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase, sEH）可将具有促血管生成作用的环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids, EETs）水解为无活性的二氢环氧二十碳三烯酸（dihydroxyeicosatrienoic acids, DHETs）；sEH特异性抑制剂TPPU可升高EETs水平，研究人员既往证实TPPU通过SLIT3/HIF?1α轴促进H型血管（type H vessels，高表达CD31与EMCN的内皮细胞亚型）与成骨偶联，但其是否通过ECs?MSCs互调调控SCs分化及活性尚不明确。因此，本研究探讨TPPU是否经内皮?间质Notch信号诱导FABP5⁺SCs形成与活化，从而促进软骨内成骨及骨折愈合。

主要技术方法

研究人员采用C57BL/6J孕鼠自妊娠第14天至产后1周每日灌胃给予TPPU（3 mg/kg，溶于PEG400）或对照溶媒，获取子代新生小鼠评估长骨生长与SCs变化；建立C57BL/6J小鼠胫骨闭合横行骨折模型，术后隔日灌胃TPPU或对照评估骨折愈合。体外采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与人牙髓干细胞（hDPSCs，经流式鉴定具MSCs表型与多向分化潜能）进行直接接触共培养（1:1比例），部分实验对HUVECs进行HIF?1α敲低慢病毒感染；另将原代小鼠软骨细胞加入共培养体系评估软骨降解。通过RT?qPCR与Western Blot检测FABP5、MMP9、DLL4、NOTCH1、HIF?1α等分子表达；组织学采用H&E、Safranin O?Fast Green染色计算生长板HC/PC比值，免疫组化（IHC）与免疫荧光（IF）检测FABP5⁺、MMP9⁺SCs分布及Notch通路分子共定位；应用γ?分泌酶抑制剂RO4929097阻断Notch通路验证功能；Micro?CT分析骨微结构参数（BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp等）；TUNEL法检测软骨细胞凋亡。

研究结果

3.1 TPPU Promotes Endochondral Ossification and Increases SCs Number in Newborn Mice

对TPPU处理孕鼠所产子代股骨进行分析，结果显示TPPU组仔鼠体重更高，生长板HC/PC比值降低、肥大软骨区缩小，干骺端软骨残留减少；Micro?CT示骨体积分数（BV/TV）与骨小梁厚度（Tb.Th）增加、骨小梁分离度（Tb.Sp）下降。IHC与IF显示TPPU显著提升COJ区FABP5⁺及FABP5⁺MMP9⁺SCs数量，且SCs紧邻EMCN⁺血管芽；MMP13在FABP5⁺细胞中比例亦升高。结论：TPPU促进HC吸收、加速软骨内成骨，并增加生长板下FABP5⁺SCs数目与基质降解活性。

3.2 TPPU Induces FABP5⁺Cells in Co?Cultured HUVECs and hDPSCs to Degrade Chondrocytes

HUVECs?hDPSCs共培养体系经成骨诱导加TPPU处理后，FABP5与MMP9在mRNA及蛋白水平显著上调，IF确认hDPSCs中FABP5⁺与MMP9⁺细胞增多。加入原代软骨细胞后，TPPU增强软骨区域MMP9表达、破坏软骨细胞F?actin骨架并诱导其凋亡，而单独处理HUVECs或hDPSCs无明显效应。结论：TPPU依赖ECs?MSCs互作诱导hDPSCs向FABP5⁺SC样细胞分化并促进软骨降解。

3.3 TPPU Activates NOTCH Signalling to Increase FABP5⁺SCs in Co?Cultured Cells

共培养中TPPU上调DLL4（HUVECs）与NOTCH1（hDPSCs）的mRNA及蛋白表达，NOTCH1与FABP5共定位。应用γ?分泌酶抑制剂RO4929097阻断Notch信号后，DLL4、NOTCH1、FABP5及MMP9表达均被抑制，hDPSCs中FABP5⁺SCs减少。结论：TPPU通过激活内皮?间质Notch信号通路上调FABP5⁺SCs形成与MMP9分泌。

3.4 TPPU Activates NOTCH Signalling in Co?Cultured Cells by Elevating HIF?1α Expression Within the Endothelial Compartment

TPPU提高共培养体系中HIF?1α蛋白水平；HUVECs特异性敲低HIF?1α后，共培养细胞中FABP5、DLL4、NOTCH1的mRNA与蛋白表达下调，TPPU诱导的FABP5⁺细胞消失。结论：TPPU通过上调内皮细胞HIF?1α，进而激活DLL4?Notch轴促进MSCs向FABP5⁺SCs分化。

3.5 TPPU Promotes Fracture Healing by Increasing FABP5⁺Cells and Enhancing MMP9 Signal in the Fracture Region

小鼠胫骨骨折模型给予TPPU灌胃后，Micro?CT示骨折端骨痂BV/TV、骨小梁数量（Tb.N）、Tb.Th升高，Tb.Sp降低；IHC与IF显示骨折线区FABP5⁺SCs增多、MMP9与NOTCH1表达上调。结论：TPPU通过增加骨折部位FABP5⁺SCs及其MMP9分泌加速软骨内成骨改建，促进骨折愈合。

讨论与结论总结

既往对软骨吸收细胞的研究集中于破骨细胞与血管相关破骨细胞（vessel?associated osteoclasts, VAOs），而本研究聚焦FABP5⁺SCs这一MSCs来源的特殊软骨降解细胞。研究人员发现TPPU并非直接作用于SCs，而是通过升高EETs水平→上调HUVECs中HIF?1α→增强DLL4表达→激活hDPSCs/SCs中Notch信号→诱导FABP5与MMP9表达→促进SCs活化与软骨基质降解→加速软骨内成骨及骨折修复。该研究同时指出局限性：EETs与SCs直接关联证据不足、缺乏长期随访及关节炎或骨质疏松等病理模型验证。总体而言，本研究揭示sEH抑制经HIF?1α?Notch介导的内皮?间质互作调控Septoclast活性新机制，为以sEH为靶点干预骨发育障碍与骨折延迟愈合提供了实验依据。本文发表于Cell Proliferation。

研究结论原文翻译：本研究证明TPPU通过增强内皮细胞与间充质细胞间的HIF?1α?Notch信号通路提高Septoclasts活性，从而促进长骨生长与骨折愈合。药理学抑制sEH可通过同时刺激软骨吸收与新骨形成调控软骨内成骨，在骨发育与修复中具有潜在治疗价值。