《ChemBioChem》：A Constellation of Fluorescent Biosensors to Illuminate the Galaxy of Protein Kinases
蛋白激酶（Protein kinases, PKs）是一类催化蛋白质底物磷酸化的酶，参与多种生物信号通路。PKs可依据作用机制与调控方式区分，与众多病理过程密切相关，因此是重要的生物标志物及治疗药物开发靶点。鉴于其重要性，学界已开发出多种策略与技术用于PKs的检测、定量及动态行为研究，涵盖放射性、抗体依赖型方法，以及生化、激酶组学（kinomic）和生物传感技术。
大量荧光生物传感器已被定制开发，用于在体外及成像场景中报告PKs活性。这些工具能让研究人员在复杂样本中高灵敏度、动态地监测PKs活性，为在天然条件下及药物刺激或抑制后研究PKs行为提供了新途径，补充了遗传学、转录组学和蛋白质组学方法的功能信息。本综述聚焦不同PK家族，以及可用于报告、分析和成像AGC、CMGC、CAMK、TK和TKL激酶的各类荧光生物传感器与化学传感器。
1 引言
蛋白质的磷酸化修饰早在20世纪初即被发现，早期研究观察到卵黄磷蛋白中存在磷氮比为1:3的磷酸化组分，但当时尚未明确具体的磷酸化基序及涉及的氨基酸种类。1932年，磷酸丝氨酸的发现首次证实了磷酸氨基酸的存在，但蛋白磷酸化的功能仍不明确。1954年，大鼠肝线粒体糖原磷酸化酶的研究完整解析了蛋白磷酸化的酶促过程；1955年，Krebbs和Fischer进一步发现ATP和二价离子参与肌肉糖原磷酸化酶b向a的转化，由“PR”（ prosthetic group-removing）酶催化。蛋白磷酸化由蛋白激酶（PKs）和磷酸酶的拮抗作用调控，可修饰高达30%的全部细胞蛋白，显著影响蛋白构象、活性及整体功能。
PKs广泛存在于大多数生物中，从原核生物（古菌和细菌）到单细胞及多细胞真核生物（真菌、哺乳动物、植物），近年甚至在病毒中也有发现。高等真核生物（哺乳动物、植物、无脊椎动物等）基因组中编码的PKs占比可达2%，人类基因组中约有514个PK基因，且其高度保守性反映了其功能重要性。PKs参与多种信号通路，在细胞生长、分裂、存活、死亡、分化、代谢、炎症和免疫反应等关键生物学过程中发挥调控作用。此外，PKs在多种人类病理状态下常过表达或失调，最典型的是癌症、炎症性疾病，还包括糖尿病、心血管疾病及神经退行性疾病。因此，PKs既是重要的疾病生物标志物，也是极具吸引力的药理靶点，针对其开发的多种小分子抑制剂已有不少获批用于临床治疗。
2 蛋白激酶家族、作用机制与调控
传统上PKs被分为丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶和双特异性激酶亚家族，但基于磷酸基团转移的氨基酸受体差异，目前已报道9种不同的磷酸化机制，最常见的是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化；组氨酸磷酸化在后生动物磷酸化组中较少见，但在细菌和酵母中广泛存在；天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、精氨酸和赖氨酸也可发生磷酸化，但由于磷酸键不稳定性，这类修饰更难研究。本综述聚焦丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化相关的PKs。
2.1 蛋白激酶的结构、活性与调控
PKs具有高度保守的核心结构与催化结构域，包含多个参与催化活性和调控的子结构域。所有PKs均呈现非常相似的结构折叠，由独立的N端和C端叶构成，中间为催化裂隙，同时具备高度的结构可塑性。PKs会发生显著的构象转变，与其功能状态直接相关：活性激酶的构象与失活激酶不同，尤其是底物识别和激酶调控相关的序列与区域差异明显，而活性激酶的催化结构域采用保守的折叠模式。以CDK2为例，其单体形式的ATP口袋在N端叶中，未与催化裂隙及底物结合域对齐，激活环（T-loop）也无法让底物稳定结合；CDK2的构象激活涉及N叶旋转，使ATP口袋靠近催化裂隙，同时C叶异构化，将激活环稳定在允许底物进入催化位点的位置。
尽管整体结构同源，不同PKs的一级序列和调控模式差异显著，底物识别特异性也被精细调控，许多激酶会利用远离催化位点的结合位点招募底物，以提高催化效率和特异性。PKs需要磷酸供体（通常为ATP）和磷酸受体（氨基酸侧链），磷酸转移步骤由激酶结构域中一组高度保守的氨基酸催化，这些氨基酸协调ATP-2Mg2+复合物，将γ-磷酸朝向外侧，对准底物的羟基。这些氨基酸主要包括DFG序列（184–186，PKA）和HxD基序（164–166，PKA）中的天冬氨酸，以及非保守的PKA K168等残基，后者可稳定ATP磷酸基团的负电荷。
PK活性受到严格的时空调控，可通过多种方式被抑制或激活：内源性抑制剂（如CDK4的p16、CDK2的p27）使其维持在失活构象；翻译后修饰（如磷酸化）调控构象与功能；部分PKs需要特定辅因子或伙伴才能激活，例如细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）依赖细胞周期蛋白（cyclin）结合实现构象激活。此外，底物序列之外的基序与激酶的相互作用可提高磷酸化速率，如ROCK-I需要其αG螺旋与底物RhoE的效应区相互作用才能完成底物磷酸化。部分PKs通过同源或异源二聚化激活，典型代表是受体酪氨酸激酶；还有PKs会发生亚细胞定位变化，如ERK激活后会磷酸化SPS基序，与Imp7相互作用并转位至细胞核，磷酸化参与细胞增殖的转录因子。
PKs是信号网络的关键节点，与大量调控或支架蛋白互作，介导细胞间和细胞内的信号传递，确保适当的细胞响应。磷酸化底物会被互作蛋白识别，形成蛋白质互作网络，有效介导信号传导。PKs常参与复杂的调控网络和反馈回路，如胰岛素受体（INSR）通路：胰岛素结合INSR促进其激活并磷酸化底物IRS，进而激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）产生第二信使，招募并激活PDK1，继而激活PKB和PKC，最终调控葡萄糖代谢、细胞存活、脂质合成等相关基因与蛋白。PKB还间接调控S6K，后者磷酸化IRS-1和IRS-2并促进其降解，形成负反馈回路。
底物识别涉及激酶结构域不同区域的残基，部分作为对接域促进底物招募，其他直接参与催化裂隙内的底物结合。底物的磷酸化位点周围共有序列决定特异性，例如SYK酪氨酸激酶偏好酸性氨基酸，而PAKs STE20激酶偏好碱性氨基酸。共有底物序列多为线性，但也有结构型共有基序，如PKC磷酸化的α-微管蛋白，其碱性赖氨酸残基在空间上邻近磷酸化位点，形成结构共识基序。仅有共有序列通常不足以实现选择性识别，对接域提供了额外的选择性，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）虽共享相似的底物共有序列，但通过激酶和底物上的特异性对接位点实现通路特异性。
2.2 人类蛋白激酶
人类PKs中近473个属于真核蛋白激酶（ePK）超家族，分为7个家族，另有45个非典型PKs，共同构成人类激酶组的518个成员，7个家族分别为AGC、CAMK、CKI、CMGC、STE、TK和TKL。
AGC激酶家族包含60个激酶，分为14组和21个亚组，包括2个假激酶，代表性成员有PDK1、PKA、PKC和Akt。其激活主要受两个基序调控：激活片段（T-loop）和位于催化结构域外的疏水基序（HM）。HM通过与PIF口袋（PDK1相互作用片段，位于αB和αC螺旋之间）互作调控活性，该互作可影响ATP和底物结合及激酶活性本身，既可以是分子内也可以是分子间作用，部分AGC激酶的HM磷酸化可稳定该互作。多数AGC激酶偏好底物磷酸化位点-2、-3和-5位的碱性残基，参与癌症、糖尿病、心脏病、阿尔茨海默病和精神分裂症等多种疾病。其中PKA（蛋白激酶A，或cAMP依赖性激酶）是广泛表达的激酶，参与GPCR和激素相关信号通路及癌症进程，其定位和活性通过A-激酶锚定蛋白（AKAPs）调控；PKB/Akt调控葡萄糖代谢和细胞存活，参与癌症和糖尿病发生；PKC是最大的AGC亚组之一，包含9个成员，靶向CD44、多配体蛋白聚糖4或LGL等蛋白，调控细胞迁移和极化，与癌症和心脏疾病相关。
钙调蛋白依赖性激酶（CAMK）通常由钙（Ca2+）复合物激活，但部分成员不受钙调蛋白调控。人类有74个CAMK，主要在脑中表达，含量可达总蛋白的2%。CAMKII缺陷小鼠存在空间学习和记忆障碍，该激酶可形成12个亚基的全酶，组装为同源或异源复合物，Ca2+/钙调蛋白刺激后可在亚基间发生Thr286自磷酸化，使激酶在无Ca2+/钙调蛋白时仍保持组成型活性，被称为“分子记忆”，但此类激活的激酶活性显著低于初始Ca2+/钙调蛋白刺激的水平。
酪氨酸激酶（TKs）共90个人类TKs，特点是磷酸化酪氨酸而非丝氨酸或苏氨酸，分为受体酪氨酸激酶（RTKs，58个，如INSR、ErbB受体）和非受体酪氨酸激酶（NRTKs，32个，如Abl、Csk、Src、JAK）。TKs参与生长、代谢、免疫反应、分化、黏附、运动和细胞死亡的细胞间信号传导，许多是人类癌基因，在多种癌症中失调，也参与代谢性疾病（如INSR与胰岛素抵抗）、免疫反应和发育过程。RTKs具有保守的丝氨酸-苏氨酸激酶结构域，胞外区识别肽类配体和激素，胞内区包含激酶结构域；配体结合通常诱导RTK二聚化并发生自磷酸化，增强激酶活性，并通过磷酸酪氨酸识别结构域（SH2或PTB）招募下游信号蛋白。NRTKs大多通过激活环的酪氨酸磷酸化调控，多数情况下磷酸化提高激酶活性，激活环外的额外酪氨酸磷酸化可对活性进行正或负调控。NRTKs功能类似RTKs，但受体与激酶是两个独立蛋白，如JAKs（Janus激活激酶）与细胞因子受体关联，参与造血、炎症和免疫反应，配体结合诱导受体二聚化，招募并激活JAK，后者磷酸化受体的对接位点，再磷酸化并激活Stat转录因子，使其转位至细胞核启动应答。
酪氨酸激酶样激酶（TKLs）包含多种具有丝/苏氨酸或酪氨酸激酶活性的激酶，参与发育、分化和信号传导，是多细胞生命所必需的，序列与酪氨酸激酶组相似，人类有43个TKLs，包括著名的RAF激酶（参与RAS-RAF-MEK-ERK通路）、丝/苏氨酸激酶受体（STKR，激活素和TGFb配体受体）等亚组。RAF激酶以A、B、C-Raf的同源/异源二聚体形式发挥功能，主要磷酸化MEK1和2，其活性受多个磷酸化位点调控，参与细胞过程调控，失调（尤其是RAF）可导致癌症。
CMGC激酶家族名称源于四个主要亚家族的首字母：CDKs、MAPKs、糖原合成酶激酶（GSKs）和CLKs，多为丝/苏氨酸激酶，部分为双特异性激酶，共62个激酶，分为8个亚组。其特征是有保守的激酶结构域和位于αG螺旋后的特定区域“CMGC插入区”，参与蛋白伙伴互作；还有一个位于APE基序前的保守精氨酸（或赖氨酸，称为CMGC-精氨酸），负责识别底物磷酸化位点P+1位的脯氨酸。CMGC成员是细胞周期进展、转录、信号转导、RNA剪接和应激反应的关键调控因子，常需要结合调控伙伴，并受多位点磷酸化调控。其中CDKs是丝/苏氨酸激酶亚家族，受细胞周期蛋白结合调控，最初被认为仅调控细胞周期，现已知参与细胞生长、衰老、转录和代谢等多种过程，在癌症中常过度激活，CDK4/6抑制剂已有多个获FDA批准用于肿瘤临床治疗。MAPKs激酶参与细胞增殖、分化、运动和凋亡，通常位于三级通路末端，如Raf/Mek/Erk通路中的Erk，人类有14个MAPKs，分属7条通路，其效应物多为转录因子，失调广泛参与癌症发生。GSKs包含GSK-3α和GSK-3β，失调可导致2型糖尿病、癌症、抑郁症、精神分裂症和阿尔茨海默病，参与WNT受体的β-连环蛋白依赖通路，与腺瘤性息肉病 coli、Axin和CKIα形成“破坏复合物”，通过磷酸化β-连环蛋白介导其溶酶体降解。DYRKs是不典型CMGCs，在细胞周期调控中起多重作用，人类DYRKs分为两类：I类为核蛋白，II类为胞质蛋白，仅能通过分子内自磷酸化催化环的酪氨酸磷酸化，无法磷酸化其他酪氨酸残基。
STE激酶因与酵母Sterile 20蛋白（Ste20p）同源而得名，共28个激酶，分为两组，主要区别在于激酶结构域在序列中的位置：P-21激活激酶（PAK）的激酶结构域位于C端，GCK位于N端。部分STE激酶（PAK1和PAK4）偏好磷酸化位点附近的精氨酸，尤其是-2位的精氨酸。PAK1通常以无活性同源二聚体形式存在，与小GTP酶结合后发生构象改变，解离自抑制结构域并解离二聚体，两个活性亚基相互磷酸化激活环，完成激酶激活，参与细胞存活、凋亡、记忆、渗透耐受等过程，失调与智力障碍、癌症、高血压或听力损失相关。
酪蛋白激酶（CKI）是人类最小的激酶家族，仅12个激酶，多为CK1蛋白的亚型或剪接亚型，广泛表达并参与细胞增殖、凋亡、昼夜节律等多种生理过程。CKIs为单体PKs，除APE基序被SIN（Ser-Ile-Asn）替代外，含有常规保守序列基序，且不需要激活环磷酸化，为组成型活性。其共有底物序列为磷酸化位点前两位的酸性氨基酸，偏好已磷酸化的丝氨酸或苏氨酸，因此也被称为“磷酸导向激酶”。CK1δ和ε可在电离辐射后磷酸化p53的Thr18，破坏p53与Mdm2的互作，稳定并激活p53，该过程由DNA激酶磷酸化p53的Ser15形成CKI共有序列触发。
非典型蛋白激酶在一级结构上与传统激酶无相似性，但已解析结构的非典型激酶大多具有经典激酶折叠，包含β折叠富集的N叶和α螺旋富集的C叶，且保留传统激酶的DFG、HxD和APE基序。人类激酶组中还有9个不属于上述7个家族的激酶：Alpha、ABC1、A6、BRD、PDHK、PIKK和Rio，尽管序列差异大，但其参与的生物学过程与传统激酶类似，如RIO激酶参与rRNA加工，部分非典型激酶（如BCR和BRD）与癌症发生相关。
NME家族是所有后生动物中唯一记录的组氨酸激酶家族，人类有10个成员，最初被描述为核苷二磷酸激酶，后因抗转移功能得名（nonmetastatic）。NME激酶具有核苷二磷酸激酶活性、组氨酸激酶活性、丝氨酸激酶活性和天冬氨酸激酶活性，形成由两个三聚体组成的六聚体，三维结构与丝/苏氨酸和酪氨酸激酶同源性低，其催化口袋内的核苷酸磷酸基团取向与传统激酶相反，因此以组氨酸自磷酸化为中间步骤，再转移磷酸基团到底物，拥有多种底物，参与K-Raf抑制、钙通道TRPV5调控等过程。
3 蛋白激酶检测、分析与成像技术
鉴于PKs在生理病理过程中的核心作用，学界已开发多种策略和技术用于在体外、培养细胞系及体内（主要是癌症模型）检测PKs。
3.1 传统PK检测方法：放射性、抗体与组学技术
早期PK检测依赖抗体，PK活性通过靶向底物磷酸氨基酸的抗体或放射性32P ATP监测，但这些方法为终点法，仅适用于体外，因此需要更多替代技术。遗传分析可提供PK编码基因的变异信息，识别点突变、剪接亚型、缺失或截断，在临床诊断中，当特定PK存在致病相关突变、基因扩增或染色体重排时具有重要价值。转录组和蛋白质组学可提供mRNA和蛋白丰度信息，广泛用于患者样本和治疗响应中的PK群上调或下调全局分析。
3.2 全激酶组与荧光基方法
自首个基于放射性或抗原成分的生化PK活性检测后，学界已开发多种基于抑制剂、抗体、蛋白质组学和荧光/发光成分的方法表征PK活性。全激酶组阵列技术可实现人类激酶组的规模化分析，包括抗体阵列、用于磷酸蛋白分析的反相蛋白阵列（RPPA）技术，以及KinomeScan、Kinobeads等激酶抑制剂分析技术，还可结合质谱分析确定细胞对激素、抑制剂的响应或获得性耐药。但这些方法为快照式，不适合实时研究激酶活性动力学。本部分聚焦可报告PK活性的荧光与发光方法，包括基于荧光ATP、荧光标记肽底物、磷酸抗体的多组分检测，以及酶偶联法测定ATP消耗或ADP生成，如HTRF（均相时间分辨荧光）、LANCE（镧系螯合物激发）和AlphaScreen（扩增发光均相检测）等基于荧光共振能量转移（FRET）的技术，以及荧光偏振、金属离子配位荧光猝灭、酶偶联发光检测等方法。
3.3 荧光生物传感器（FBs）——PK活性的高选择性灵敏报告工具
FBs结合了生物受体（源自天然蛋白受体、蛋白互作结构域、底物或仿生材料，负责识别目标分析物）与一个或多个荧光探针，可将分析物识别转化为可检测和可测量的荧光信号（通常为荧光发射、FRET或荧光寿命成像显微镜（FLIM））。报告PK的FBs至少包含底物部分和荧光探针，部分设计还整合了磷酸氨基酸结合域（PAABD），可识别磷酸化底物，常用的PAABD包括Src同源2/3（SH2、SH3）结构域、磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域、14-3-3蛋白、叉头相关（FHA）结构域、WW结构域、WD40结构域和Plk1的PBD等。
FBs是检测复杂样本（血浆、尿液、细胞裂解液、活检组织）及天然环境（活细胞、类器官、生物体）中PK活性的有力工具，是过去二十年发展最快的光学探针类别之一，为实时、高时空分辨率研究PK行为和调控提供了新途径，广泛应用于成像领域，也被称为“报告子”或“分子间谍”，也被纳入药物发现管线用于高通量筛选。
目前已开发的FBs可分为基因编码生物传感器和合成传感器（又称化学传感器），以及基于纳米材料的荧光发光生物传感器。基因编码的PK活性报告子（KARs）通常在真核细胞中表达用于成像，或在细菌中表达纯化用于体外应用，多数由PK底物、PAABD夹在两个荧光蛋白（FPs）之间构成，依赖底物磷酸化后的FRET变化工作。合成荧光生物传感器（化学传感器）通常通过在一个肽底物上连接一个或多个适合生物传感的小分子有机荧光团及PAABD构建，荧光团可直接响应邻近磷酸化，或通过磷酸化后肽骨架的构象变化改变荧光发射，也包括螯合增强荧光、金属离子/镧系结合、猝灭/去猝灭和聚集机制等非传统设计。肽基化学传感器可通过显微注射、细胞穿透肽（CPPs）或纳米材料递送进入活细胞成像，但更多用于体外复杂样本（细胞提取物、患者活检）中的PK活性定量，是诊断和即时检测的有前景工具。
两类传感器均通过荧光发射变化响应PK磷酸化，底物部分提供对目标PK的选择性，荧光团选择决定灵敏度和动态范围，整合对接域可提高PK识别效率，优化响应。目前两类传感器已覆盖多数PK家族，6.4%的人类PKs同时有基因编码和化学传感器可用，9.3%仅基因编码传感器可用，1.4%仅化学传感器可用。
3.4 AGC激酶荧光生物传感器
目前已开发大量基因编码FBs用于活细胞成像PKA、AKT/PKB、PKC或PKD活性。PKA的基因编码单链FRET生物传感器是最早开发的激酶报告子之一，迄今已有超过80种遗传生物传感器被报道，包括ART（cAMP响应示踪子）、AKAR系列（cAMP依赖性激酶活性报告子）等，经过多代优化，动态范围和亚细胞定位分辨率不断提升，还开发了单荧光蛋白的激发比率型KARs（ExRai-KARs）、基于二聚化依赖的单RFP传感器（ddRFP）、激酶易位报告子（KTRs，通过磷酸化后核质穿梭变化报告活性）等多种设计，实现了多色复用成像和高分辨率亚细胞定位检测。
合成化学传感器方面，开发了多种基于环境敏感荧光团、自报告策略、深猝灭策略、金属离子螯合增强荧光（如Sox染料）、镧系离子配位、聚集猝灭等多种机制的肽基传感器，可高选择性检测PKA、PKC、Akt等AGC激酶活性，部分已实现细胞裂解液和活细胞成像应用。
3.5 CAMK激酶荧光生物传感器
针对钙调蛋白依赖性激酶，开发了Camui系列基因编码FRET传感器，通过全长CaMKII夹在CFP和YFP之间，在激酶激活时发生构象变化导致FRET降低，用于神经元和心肌细胞中CaMKII活性的时空成像；还开发了FRESCA传感器、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）传感器、AMPK活性报告子（AMPKAR）等，分别用于对应激下AMPK动态、Ca2+振荡响应等的成像。合成化学传感器方面，针对MAPKAPK2、PIM2等CAMK家族成员开发了Sox基化学传感器和自组装肽传感器，可实现高灵敏检测。
3.6 CMGC激酶荧光生物传感器
CMGC家族的基因编码传感器以MAPKs（尤其是ERK1/2）和CDKs为重点。ERK传感器从早期的Erkus、EKAR系列发展到EKAREV、EKAREN系列，通过优化柔性接头、荧光蛋白和底物序列，大幅提高了动态范围和特异性，还开发了单FP的ERK KTRs、基于液液相分离的ERKSPARK传感器、ddFP基传感器等，实现了单细胞水平、类器官和活体中的ERK动态成像。针对CDKs，开发了基于易位、FRET的多种传感器，以及本团队开发的CDKACT系列肽基化学传感器，通过定制化底物和PAABD，实现了CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6的高选择性检测，可用于细胞裂解液、活检样本、活细胞和体内成像，结合碳纳米管构建的杂化纳米生物传感器进一步提高了灵敏度，已在黑色素瘤、胶质母细胞瘤、间皮瘤等疾病模型中验证了应用价值，还可用于CDK抑制剂疗效评估。
3.7 TK和TKL激酶荧光生物传感器
针对酪氨酸激酶，开发了基于SH2结构域识别磷酸酪氨酸的基因编码FRET传感器，如Abl传感器、Picchu（EGFR激活传感器）、Pickles（Bcr-Abl传感器）、Src传感器等，用于活细胞成像激酶激活动态、药物响应和耐药评估，还开发了INSR、Raf等激酶的传感器，用于信号通路动态研究。合成化学传感器方面，针对Src、Abl等开发了自报告、深猝灭、镧系配位、基于EF手基序的发光传感器，以及可穿膜的肽探针，实现了细胞水平和活细胞成像应用。
4 总结与展望
PKs是多数生物学过程的核心，是已确立的治疗靶点，但作为生物标志物的开发仍不足。虽然部分PK家族已被深入研究，但其他家族在结构和功能上仍缺乏充分表征。在细胞内环境中检测PK活性如同大海捞针，而基因和合成传感器的开发为这一挑战提供了解决方案，这些不同形态、大小和光谱特性的报告子为揭示PK行为、可视化其时空动态提供了可能。高灵敏选择性荧光传感器的实现依赖于多项技术优化：选择具有高信噪比和动态范围的荧光蛋白或合成探针、优化底物和对应PAABD、整合对接域，以及化学传感器中引入磷酸依赖的金属螯合或镧系结合等智能设计。基因编码FBs更适合培养和活体成像，化学传感器则是体外、细胞裂解液和活检样本中定量检测PK活性的宝贵工具。得益于技术发展，多色复用成像和多重分析已成为可能，为预测性诊断提供了新途径。
目前大部分基因编码和生物传感器针对AGC、CMGC、CAMK和TK家族，针对其他激酶家族的活性报告子仍较少，限制了对其功能和活性的全面理解。植物、细菌、病毒中的PK研究仍较滞后，但植物PK荧光生物传感器正在兴起，跨物种的生物传感器重定位也为拓展应用提供了可能。未来，优化和开发生物传感器与化学传感器以实现PK活性谱分析，将是精准诊断的重要发展方向。
