《Oncogene》：Transcriptomic profiling identifies immunotherapy-responsive phenotypes in microsatellite-stable metastatic colorectal cancer
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常规免疫检查点抑制剂（ICI)在微卫星稳定型转移性结直肠癌(MSS mCRC)中仍基本无效，其低肿瘤免疫原性及转移灶间分子异质性是治疗的根本障碍。研究人员对接受botensilimab (BOT；Fc增强型抗CTLA-4) ± balstilimab (BAL
常规免疫检查点抑制剂（ICI)在微卫星稳定型转移性结直肠癌(MSS mCRC)中仍基本无效，其低肿瘤免疫原性及转移灶间分子异质性是治疗的根本障碍。研究人员对接受botensilimab (BOT；Fc增强型抗CTLA-4) ± balstilimab (BAL；抗PD-1)治疗的MSS mCRC患者的转移灶和原发灶活检样本进行了全面转录组学分析。自组织映射(SOM)机器学习将肿瘤分为四种分子类型，包括以代谢重编程和免疫抑制特征为特点的肝样(LIV)亚型，以及与泛癌分类一致的增殖型(PRO)、炎症型(INF)和间充质型(MES)。PRO、INF和MES类型分别富集于上皮肿瘤细胞、免疫细胞和成纤维细胞，沿可塑性梯度定义了免疫耗竭、免疫富集和纤维化状态。研究人员观察到治疗相关转录组向免疫富集状态的转变，表现为抗原呈递、T细胞招募和细胞毒性通路上调。INF和MES肿瘤类型相比PRO和LIV类型显示出改善的临床反应和生存期。该研究鉴定了沿免疫表型轴排列的不同肿瘤微环境状态，该轴以CD74、干扰素-γ和APOBEC3表达为标志，此前已在原发CRC中被鉴定。研究发现为MSS mCRC中免疫治疗反应的分子相关性提供了新见解，可能为将来扩展ICI疗效至既往无应答肿瘤的治疗策略提供参考。
该研究发表于《Oncogene》，旨在解决微卫星稳定型转移性结直肠癌(MSS mCRC)对常规免疫检查点抑制剂(ICI)治疗抵抗这一临床难题。结直肠癌(CRC)是全球第二大致死性恶性肿瘤，转移性患者5年生存率仅13%。尽管免疫治疗已改变多种癌症的治疗格局，但在CRC中，其疗效主要局限于错配修复缺陷(dMMR)或微卫星高度不稳定(MSI-H)的少数肿瘤。相反，约95%的转移性CRC属于MSS型，对靶向PD-1或CTLA-4的常规ICI基本无效。这种抵抗性与低新抗原负荷、抗原呈递受损、免疫抑制性肿瘤微环境(TME)以及转移灶间高度分子异质性密切相关。近年来，Fc增强型抗CTLA-4抗体botensilimab (BOT)联合抗PD-1抗体balstilimab (BAL)在难治性MSS mCRC中显示出令人鼓舞的临床活性，客观缓解率达22%，疾病控制率达61%，但仍有相当部分患者治疗失败，其分子决定因素尚不清楚。基于此，研究人员开展了这项针对BOT±BAL治疗的MSS mCRC患者转移灶和原发灶活检样本的首个全面转录组学分析。
本研究的主要关键技术方法包括：从49例MSS mCRC患者的多部位转移灶（肝、肺、腹膜、淋巴结、盆腔，共63例样本）及2例原发灶获取福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织进行批量mRNA测序；16例患者具有治疗前(PRE)和治疗中(ON)配对样本。采用自组织映射(SOM)机器学习算法进行RNA-seq表达分析，将17,250个基因表达数据转化为1,600个元基因图谱进行模式识别。应用CIBERSORTx进行细胞类型反卷积，EcoTyper框架分析细胞类型群落，ESTIMATE算法进行纯度评估。结合多种外部分类系统进行验证，包括泛癌TME分类(Bagaev分型)、泛转移癌分类(PMC)和CRC共识分子分型(CMS)。
研究结果部分，"MSS mCRC转移性肿瘤可分为不同分子类型"：通过SOM非监督相似性和层次聚类，研究人员将肿瘤样本分为四种最稳定且功能协调的分子类型(MT)，即肝样(LIV)、增殖型(PRO)、炎症型(INF)和间充质样(MES)型。LIV型富集胆汁盐、脂质和脂肪酸代谢标志物；PRO型富集有丝分裂期和增殖性干细胞特征；INF型富集免疫细胞、炎症和细胞因子相关特征；MES型富集膜、突触相关和基质特征。各MT具有特异性上调基因，如LIV型的APOA2、APOB和FGG/FGA/FGB，PRO型的BIRCS5和COX19，INF型的CD74和CXCL9，以及MES型的COL1A1/COL16A1和HIC等。通过三元图可视化，PRO、INF和MES三种MT形成连续转录状态的简化分层，而LIV肿瘤明显偏离这一模式。活检部位对转录组景观有显著贡献，肝、肺、腹部活检的核心模块分别富集肝脏功能、肺组织功能和内皮/基质特征，但MT与活检部位代表不同的肿瘤内在特征和组织特异性状态组合。
"TME生态系统沿可塑性梯度富集不同细胞成分"：CIBERSORTx细胞类型反卷积显示，从LIV、PRO到INF再到MES，上皮肿瘤细胞(EPCAM)逐渐减少，而主要为成纤维细胞富集的细胞(CD10)相应增加，免疫细胞(CD45)在INF中达到峰值。EcoTyper分析鉴定了四种TME生态型(ET)，其中EPCAM富集的E1主要涵盖LIV和PRO型，免疫细胞富集的E2和成纤维细胞富集的E3分别与INF和MES型广泛对应。基于7基因特征的干扰素评分将肿瘤分为干扰素高(IT clusters A-B)和低(IT clusters C-D)的免疫类型，高干扰素表型与高CD45、低EPCAM及免疫细胞亚群 abundance相关。INF和部分MES与干扰素高型对应，PRO和LIV与干扰素低型对应。通过将EPCAM、CD45和CD10细胞类型分数映射到SOM图谱，研究人员构建了能区分MT的三元组成图。INF模块与CD4+和CD8+ T细胞、滤泡辅助细胞、γδ细胞、NK细胞、活化树突状细胞和促炎M1巨噬细胞高度相关；MES模块与成纤维细胞、调节性T细胞和抗炎M2巨噬细胞相关；PRO模块与EPCAM肿瘤细胞、CD4记忆T细胞、活化肥大细胞和初始巨噬细胞相关。
"泛癌和CRC分类与C-800-01转移性肿瘤类型一致"：应用三种成熟分类系统验证发现，Bagaev分型中免疫荒漠(D)和纤维化(F)肿瘤位于LIV和PRO型，免疫富集伴纤维化(IEF)和不伴纤维化(IE)肿瘤主要与INF和MES型相关。泛转移癌分类中，s1(细胞周期)对齐LIV和PRO，s2(代谢、纤毛内皮)和s3(表观遗传学、干扰素高)对齐INF，s4(上皮-间充质转化)对齐MES。CRC共识分子分型中，CMS4对齐MES，CMS2对齐 zinc PRO，CMS3对齐LIV和PRO，INF肿瘤的干扰素高A簇显示CMS1样免疫原性特征。这些一致性表明，尽管样本量有限，MT分型反映了共享的功能景观。
"免疫类型与APOBEC3表达和基因组不稳定性相关"：高干扰素免疫表型评分与CD74表达、INF核心模块、durvalumab联合tremelimumab治疗MSS mCRC的应答特征以及免疫排斥常数(ICR)评分相关。差异基因表达分析显示，APOBEC3-C/D/F/G/H基因表达与干扰素IT评分相关，在INF型中表达最高，MES型中次高，且在CMS1(免疫激活)和LMS4(炎症)亚型中也较高。相反，APOBEC3-B与干扰素IT评分负相关。APOBEC3基因编码的胞苷脱氨酶家族失调可导致局部突变爆发(kataegis)，进而与免疫原性增加、PD-L1表达、干扰素表达及免疫治疗反应改善相关。值得注意的是，IT评分与干扰素基因活性和APOBEC3表达强相关，但未被全外显子测序(WES)的常规肿瘤突变负荷(TMB)检测所捕获，因kataegis事件需全基因组测序才能有效识别。染色体臂基因表达变化提示免疫评分与CRC遗传不稳定性模式相关，干扰素高肿瘤与Chr.18p/q和Chr.22q缺失及Chr.8p和Chr.5q获得相关，而增殖性干扰素低肿瘤与Chr.13q和Chr.20p/q获得相关。
"免疫轨迹与肿瘤可塑性特征梯度相关"：来自CRC肠道上皮细胞身份丧失、细胞可塑性增加及非典型分化的特征在四种MT中差异富集：吸收性肠特征在LIV和PRO中占主导，分泌性肠和神经内分泌特征在INF中，鳞状肠特征在MES中。这种可塑性梯度表现为异质性连续体而非明确分离。ATRX(染色质重塑关键调控因子)功能丧失特征、CpG岛甲基化表型(CIMP)以及高低表达转录因子(TF)基因也与这一可塑性梯度对齐。SOM自组织特性将表达谱相似的模块排列近邻，形成异质性转录谱的连续"轨迹"。研究人员鉴定出两条轨迹：INF核心模块相关的免疫富集(IE)轨迹和MES核心模块相关的免疫耗竭(ID)轨迹，而PRO相关模块为免疫荒漠，LIV相关模块为免疫抑制状态。INF型肿瘤在IE模块中活性升高，而MES型肿瘤免疫特征降低。这一转录组景观揭示了不同的TME免疫表型(ID或IE)，并定义了从上皮向间充质状态的肿瘤细胞可塑性梯度。
"BOT±BAL治疗使肿瘤向免疫富集状态转变"：16例配对样本分析显示，BOT±BAL治疗后TME中CD45免疫细胞浸润增加，包括CD8+和CD4+ T细胞、抗肿瘤M1巨噬细胞、NK细胞和滤泡辅助T细胞，同时上皮肿瘤细胞和初始(M0)巨噬细胞减少。差异基因表达分析发现多种免疫相关基因上调，包括非耗竭T细胞标志物ZNF683、巨噬细胞介导抗肿瘤免疫关键因子CXCL9/10、M1巨噬细胞极化诱导因子干扰素-γ、促进细胞毒性的GZMA/GZMB/GZMH、增强M1极化的CCL5，以及与TME中DNA甲基化变化相关的APOBEC3-G/H。上调基因富集于白介素产生、趋化因子和干扰素信号及NK激活等免疫治疗反应相关通路；下调基因则与上皮、发育和应激状态相关。SOM图谱显示上调基因聚集在INF位点周围及IE轨迹，下调基因集中在应激、缺氧和衰老模块等ID轨迹，表明治疗推动基因活性从ID向IE轨迹的免疫原性TME转变。
"INF和MES肿瘤较PRO和LIV肿瘤显示出更好的治疗反应和预后"：临床反应分析显示，肿瘤缩小>30%的患者主要集中在INF和MES型，肿瘤增长>20%的患者富集于PRO型。基因表达谱与肿瘤大小变化的关联分析显示，PRO和LIV模块区域与肿瘤增长正相关，MES和INF模块区域负相关。鉴于各MT样本量较小，研究人员将MES与INF合并、LIV与PRO合并进行总生存期(OS)分析，结果显示干扰素高IT较干扰素低IT有更好的生存期，INF/MES型较LIV/PRO型有更好的生存期。INF和MES模块基因表达与更好OS相关(风险比HR<1)，而LIV和PRO模块表达与较差OS相关(HR>1)。无活性肝转移(LM)患者和有活性LM患者的治疗抵抗概率图显示，LIV和PRO型区域抵抗风险增加。与外部化疗(FOLFIRI)和表皮生长因子受体抑制剂(EGFRi)抵抗特征的比较显示，化疗抵抗与免疫治疗抵抗模式相似，而EGFRi敏感性则与高增殖性LIV和PRO型相关，体现了联合治疗的重要性。
讨论与结论部分，研究总结认为，这些数据和分析为理解为何部分经治、化疗难治性MSS mCRC患者能从BOT±BAL中获得持久获益提供了临床意义的框架。通过整合SOM转录组图谱与多种外部分类系统，研究一致鉴定出不同的分子类型：炎症性、免疫富集、干扰素高、APOBEC3高的类型与炎性CMS1样CRC亚型一致；间充质性、免疫富集、纤维化TME类型类似于CMS4肿瘤；增殖性和肝样类型则为上皮性、代谢性和免疫耗竭性，其中LIV型转录组由健康肝组织特征主导。这四种MT来自非监督聚类，总结了主要转录程序，反映了解释性的连续状态而非 rigid 类别。临床上，基线肿瘤属于INF/MES或干扰素高IT的患者，相比PRO/LIV、免疫冷病变的患者，具有更深的肿瘤退缩和更优的OS，尽管所有患者TMB均低且既往标准化疗和生物制剂治疗失败。
CD74、干扰素-γ特征和APOBEC3基因渐进性表达所标记的免疫表型轴的鉴定是重要发现。配对活检的纵向分析显示，BOT±BAL治疗可使部分病变沿可塑性梯度向免疫富集状态转变，CD8和CD4 T细胞、NK细胞、M1巨噬细胞和干扰素诱导性趋化因子增加，同时上皮/发育应激程序下调，支持BOT±BAL既选择又主动促进MSS mCRC免疫表型的模型。干扰素信号、APOBEC3表达与良好结局的紧密关联，且无全外显子突变计数的平行关联，提示局部超突变及相关新抗原"质量"特征可能超越常规TMB评估促进临床获益，尽管这仍需大队列DNA水平验证。值得注意的是，APOBEC3表达独立于总体突变负荷与免疫表型梯度相关，提示局部超突变促进免疫识别，使APOBEC3成为有前景的候选生物标志物和癌症免疫治疗潜在靶点。临床上，这些发现表明转录组和微环境特征，特别是干扰素高的INF/MES TME和非肝转移部位，比全局突变负荷更能预测Fc增强型CTLA-4基础免疫治疗在MSS mCRC中的获益，并为将PRO/LIV免疫冷转移灶转化为更敏感免疫表型的理性联合策略提供了概念图。
研究同时指出，样本量有限限制了统计效力和效应估计的普适性，批量转录组分析可能掩盖稀有、空间局限性细胞类型的贡献；APOBEC3的 mechanistic作用、可塑性轴与遗传不稳定性及免疫激活的关联尚需通过基因组学和功能研究在大队列中确立；蛋白质水平验证因组织有限未能实现。未来研究需整合单细胞或空间转录组学、蛋白质分析及DNA水平纵向分析等正交方法进行验证，更高纯度肿瘤材料将有助于更明确地解析肝转移灶中的肿瘤内在程序。总体而言，该研究推进了对塑造MSS mCRC转移和ICI反应分子架构的理解，肿瘤可塑性梯度、APOBEC3相关免疫原性和治疗诱导免疫重编程的鉴定为内在性和获得性耐药提供了机制见解，为生物标志物驱动的患者分层和理性治疗联合开辟了新途径。
