Col003通过降低血小板活化及NET形成，缓解小鼠脓毒症相关的凝血功能障碍

《Thrombosis Research》：Col003 attenuates sepsis-associated coagulation dysfunction in mice in association with reduced platelet activation and NET formation

　　

Xinyang Zhao|Ruoqing Lin|Ruixuan Lin|Chong Hou|Lei Xia|Songtao Shou

中国天津天津医科大学总医院急诊医学科

摘要

背景

凝血功能障碍是导致脓毒症死亡率升高的重要因素（Levi等人，2013；Gando等人，2019 [1]，[2]），其中血小板活化、中性粒细胞活化以及中性粒细胞外陷阱的形成起着重要作用。近期研究提示HSP47与静脉血栓栓塞症以及血小板/中性粒细胞活化有关（Thienel等人，2023a [3]）；不过HSP47是否在脓毒症期间促进血小板介导的NET形成及凝血功能障碍仍不明确。

目的

本研究旨在探讨热休克蛋白47在脓毒症期间血小板活化、NET形成及凝血功能障碍中的作用，并评估药物调控HSP47相关反应的潜在效果。

方法

通过盲肠结扎穿刺术建立小鼠脓毒症模型，然后用HSP47相关反应的功能抑制剂Col003处理小鼠。检测了血小板HSP47信号、组织病理学损伤、凝血参数、血小板活化情况、颗粒释放情况、血小板-白细胞聚集体形成以及NET形成情况。在主要实验中监测了小鼠7天的存活率，而在Col003给药时间实验中则评估了48小时的短期存活率。此外还使用骨髓来源的中性粒细胞进行了体外实验，以探究TLR2-MyD88通路在HSP47相关NET形成中的作用。

结果

盲肠结扎穿刺术会导致血小板HSP47信号增强、凝血功能异常、炎症细胞因子生成增加、血小板活化、血小板颗粒释放、血小板-白细胞聚集体形成以及NET形成加剧。Col003处理可减轻这些由盲肠结扎穿刺术引发的变化，并提高小鼠的7天存活率。在给药时间实验中，在盲肠结扎穿刺术前3小时给予药物时，对血小板HSP47信号、CitH3表达以及48小时存活率的影响最为显著。在血小板-中性粒细胞共培养实验中，来自盲肠结扎穿刺术小鼠的血小板会促进NET形成，而经Col003处理后的小鼠血小板则具有较低的NET形成能力。体外通路验证实验进一步表明，重组小鼠HSP47能增加骨髓来源中性粒细胞中TLR2、MyD88和CitH3的表达，而抑制TLR2或MyD88则可降低HSP47诱导的CitH3表达。

结论

这些研究结果表明，HSP47相关反应与脓毒症相关的凝血功能障碍有关，同时也与血小板活化及NET形成存在关联。早期应用Col003可减轻盲肠结扎穿刺术引发的病理变化，这说明HSP47相关通路可能是进一步研究脓毒症相关凝血障碍的潜在靶点。未来还需要更多研究来确定在脓毒症已经发生后再给予Col003是否依然有效。

引言

脓毒症是指机体对感染反应失调所导致的器官功能障碍[4]，而由此产生的凝血功能障碍则是造成器官衰竭和死亡的重要因素。其核心病理生理机制认为，内皮损伤和过度免疫性血栓形成会加重凝血功能障碍，从而形成恶性循环。

血液凝固稳态的维持依赖于血小板[5]。除了作为血栓形成的介质外，血小板还参与机体针对感染的先天免疫防御以及血管炎症反应[6]。在脓毒症的病理过程中，病原体及炎症因子首先会激活血小板，进而促使血小板与其他免疫细胞相互作用并聚集到感染部位[7]，[8]。活化的血小板会通过释放抗菌物质直接参与清除细菌病原体；因此，血小板相关指标——如血小板计数、血小板-单核细胞/中性粒细胞聚集体以及P选择素水平——被广泛认为是预测脓毒症预后的有效生物标志物[9]，[10]。

近期研究证实，中性粒细胞外陷阱在脓毒症引起的组织损伤、血栓形成以及微循环功能障碍中起着关键作用[11]。过量的NET形成不仅会直接损害内皮和组织，还会促进血小板黏附和血栓形成，进而进一步加剧脓毒症中的凝血失衡状况[12]。

HSP47属于热休克蛋白家族，是一种具有胶原特异性的分子伴侣[13]，在胶原合成和纤维化过程中发挥着重要作用[14]。先前的研究表明，HSP47可出现在人和小鼠血小板的表面，可能在血栓形成和止血过程中参与血小板与胶原的相互作用[13]，[15]。2017年，Ito等人通过化学库筛选发现，小分子化合物Col003（图2A）能够抑制HSP47与胶原的结合。有研究指出，Col003是通过与HSP47的胶原结合域结合来抑制HSP47与胶原之间的相互作用的[16]。不过，Col003在脓毒症相关凝血障碍中所发挥的保护作用是基于其对HSP47与胶原相互作用的抑制，还是涉及其他HSP47相关的信号传导机制，目前尚不清楚。近期研究显示，HSP47与静脉血栓栓塞症的形成有关，同时也会参与中性粒细胞的活化过程[3]，但其在脓毒症背景下对凝血功能的影响仍未明确。

本研究旨在探讨HSP47相关反应在脓毒症相关凝血功能障碍中的作用。我们推测，在脓毒症状态下，与HSP47相关的血小板反应可能与血小板活化、颗粒分泌、NET形成以及凝血功能异常有关。这些研究结果有助于确定HSP47相关通路，为进一步研究脓毒症相关凝血功能障碍提供潜在靶点。

章节要点

动物实验

实验用小鼠为6–8周龄的雄性C57BL/6无特定病原体小鼠，购自中国天津双利实验动物场。所有小鼠均在标准环境下饲养，环境湿度为50%，温度为20–22℃，光照周期为12小时亮/12小时暗。实验小鼠可随时获取饮水和标准鼠粮。所有实验方案均获得了天津医科大学动物伦理委员会批准（伦理许可编号：IRB2025-DW-107）。

建立盲肠结扎穿刺模型并分组

将小鼠的腹部

脓毒症小鼠体内HSP47表达升高

建立了脓毒症（盲肠结扎穿刺）组与对照组，分别在模型建立后6小时、12小时、24小时和36小时检测了血小板HSP47的表达水平。与对照组相比，脓毒症组小鼠的HSP47表达水平显著升高，且在24小时时达到峰值（图1A–C）。

Col003给药时间影响盲肠结扎穿刺术后血小板HSP47信号及短期存活率

为探究Col003给药时间对盲肠结扎穿刺术后血小板HSP47信号的影响，实验组小鼠在盲肠结扎穿刺术前6小时、3小时、手术立即前或术后3小时分别接受Col003处理。所有小鼠的外周血样本均

讨论

总体而言，本研究表明HSP47与脓毒症诱发的凝血障碍存在关联。我们的研究发现，通过Col003调节HSP47相关反应可减轻盲肠结扎穿刺术引发的凝血功能障碍，同时还能降低血小板活化、颗粒分泌、血小板-白细胞聚集体形成以及NET形成的程度。通过研究不同时间点给予Col003的干预效果，我们发现早期给予该药物效果更为显著。

CRediT作者贡献说明

Xinyang Zhao：论文撰写——初稿撰写、验证分析、方法设计、研究实施。Ruoqing Lin：验证分析、研究实施。Ruixuan Lin：研究实施。Chong Hou：研究实施。Lei Xia：研究实施。Songtao Shou：论文撰写——审稿与编辑、资金筹集。

伦理与知情同意

所有动物实验均获得了天津医科大学总医院动物伦理与福利委员会的批准（批准编号：IRB2025-DW-107），并且严格按照中国实验动物科学协会制定的规范开展。

资金支持

本研究得到了天津市重点医学学科（专科）建设项目的资助（项目编号：TJYXZDXK-3-009C）。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。