对深静脉血栓形成整体转录组及免疫代谢特征的分析揭示了脂质代谢与NETosis之间的关联轴

《Thrombosis Research》：Analysis of the whole transcriptome of deep vein thrombosis and immune-metabolic characteristics reveals the lipid metabolism-NETosis coupling axis

　　明雪|陈忠庆|郑学勋|陈宇航|张一鸣|蔡权民|刘坤|施浩源|关云标|周亚东中国福建省福州市新泉路29号福建医科大学附属协和医院血管外科摘要背景深静脉血栓形成（DVT）是一种常见的静脉血栓性疾病，会导致较高的发病率和死亡率。其发病与发展与凝血功能异常密切相关，同时也会受到炎症反应和免疫调节网络的显著影响。然而，在系统性炎症背景下DVT的分子机制，尤其是由免疫与代谢相互作用驱动的关键过程，仍需进一步阐明。方法为系统描述DVT患者的特征，我们整合了20项临床参数。通过对外周血样本进行全转录组测序，分析差异表达的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA。采用结合随机森林、LASSO和SVM-RFE的机器学习策略确定核心诊断标志物。通过单样本基因集富集分析解析免疫微环境特征，并通过定量代谢途径分析探讨中性粒细胞功能极化的代谢基础。最后，利用独立的外部验证队列（GSE48000）评估这些关键机制的稳定性及其在复发风险分层中的价值。结果临床分析显示，DVT患者的D-二聚体水平显著升高，系统性炎症指标AISI和NLR也有所上升，表明存在以髓系应激增强和淋巴细胞相对抑制为特征的炎症表型。全转录组测序筛选出以F7、MTRNR2L10和SYT16为核心的候选生物标志物组，所构建的诊断模型具有出色的区分能力。免疫解析进一步发现Neu_NETotic_Hub是DVT中的关键致病亚群，该亚群在DVT患者中显著富集，且与核心驱动基因PADI4的高表达密切相关。代谢分析显示，DVT状态下的中性粒细胞存在明显的脂质代谢重编程以及活性氧生成增加，这两者都与NETosis评分呈强正相关（r > 0.8），提示它们可能构成免疫性血栓形成的重要代谢基础。外部验证表明，脂质代谢评分和NETs相关评分均随复发风险等级的增加而上升，基于这两项指标的联合模型在识别高风险复发状态方面具有较好的区分能力，AUC值为0.825。结论本研究揭示了免疫与代谢之间的耦合机制，即脂质代谢重编程促使中性粒细胞向致病的NETotic表型发展，这一机制可能是推动DVT发病、进展及复发风险增加的重要因素。这些发现不仅加深了我们对DVT中免疫性血栓形成生物学基础的理解，还为早期诊断、复发风险分层以及针对中性粒细胞免疫代谢的靶向干预提供了理论依据。引言深静脉血栓形成（DVT）是指深静脉内形成血栓，导致静脉管腔阻塞和静脉回流受阻的疾病[1]。该病最常见于下肢，尤其在创伤、长期卧床、近期手术或患有恶性肿瘤等高危人群中更为多见[2]。传统上，DVT的形成被认为是由静脉淤滞、血管内皮损伤和高凝状态这三大病理因素共同导致的，这一经典理论被称为“维尔肖三联征”[3]。若未能及时有效治疗，DVT可引发一系列严重并发症，包括肺栓塞（PE）和血栓后综合征（PTS）。大约10%的DVT患者可能会发展为致命性的PE，20%–50%的患者则可能随后出现PTS[4]、[5]。尽管近年来抗凝治疗、机械性取栓术和溶栓治疗等传统治疗方法已有所改进，但仍有相当比例的患者会出现治疗失败、血栓复发及长期并发症，这使得DVT的管理面临诸多挑战[6]。因此，寻找新的生物标志物用于早期诊断以及潜在的治疗靶点，对于改善DVT患者的预后具有重要意义。传统观点认为DVT主要是由凝血系统功能障碍引起的，但越来越多的证据表明，炎症反应和先天免疫激活也在DVT的发病和发展过程中起着关键作用[7]、[8]。在这些机制中，中性粒细胞外陷阱（NETs）尤其受到关注。NETs是由去凝缩的染色质、组蛋白和颗粒蛋白构成的网状结构，其形成过程通常称为NETosis[9]、[10]。现有证据表明，NET的形成可通过依赖NADPH氧化酶的途径和非依赖NADPH氧化酶的途径实现。在典型的依赖NADPH氧化酶的途径中，病原体、细胞因子、补体介导的信号、血小板释放的介质或其他炎症刺激会激活NADPH氧化酶复合体，进而诱导活性氧（ROS）的产生。ROS的产生又会促进下游事件的发生，涉及髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的作用；NE会转移到细胞核内并切割组蛋白，而MPO则与NE协同作用，促进染色质去凝缩并释放NETs[11]、[12]、[13]、[14]。相比之下，非依赖NADPH氧化酶的典型途径可通过钙离子载体如A23187在实验中诱导，该物质会导致细胞内钙离子流入，进而激活PAD4，引起组蛋白瓜氨酸化、染色质去凝缩和NETs的形成[15]。除了典型的微生物触发因素外，炎症细胞因子、趋化因子以及中性粒细胞活化介质，包括IL-8/CXCL8、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、抵抗素、脂ocalin-2（LCN2）和肝细胞生长因子（HGF），以及与血小板、补体激活、自然杀伤细胞和T淋巴细胞相关免疫反应的相互作用，也可加剧NETs的形成[16]、[17]。此外，与疾病相关的中性粒细胞异质性，包括低密度粒细胞和正常密度粒细胞，再加上与NETs相关的蛋白质复合物、NETs清除功能受损以及抗NETs的自身免疫反应，可能在病理状态下进一步推动血栓炎症的加剧。在DVT中，这一免疫性血栓形成网络可通过多种机制促进血栓形成。NETs的DNA支架有助于血小板的黏附和活化、血小板聚集以及纤维蛋白沉积[18]、[19]，而NETs相关的生物活性成分，如组织因子和组蛋白，可激活凝血途径，促进凝血酶生成，激活补体系统，进而加重高凝状态[20]。过量的NETs释放还会进一步加剧炎症、内皮损伤、微血管阻塞和组织损伤，这一点在COVID-19相关的免疫性血栓形成等急性血栓炎症疾病中得到了体现[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。因此，限制异常的NETosis可能是一种减少宿主组织损伤并延缓血栓进展的潜在策略。近年来，脂质代谢与NETs形成之间的相互作用日益受到关注。研究表明，氧化低密度脂蛋白（OxLDL）等脂质代谢产物可通过激活相关免疫受体来诱导NETs释放，从而加重血栓病变[26]。与此同时，线粒体来源的损伤相关信号，包括循环中的线粒体DNA以及线粒体DNA拷贝数的变化，也越来越被认为会促进系统性炎症、内皮活化以及血栓形成的易感性[27]、[28]。然而，关于脂质代谢、线粒体应激相关的转录信号与DVT中NETs之间分子机制的系统性研究仍然有限，我们对驱动免疫与代谢耦合的关键基因和信号通路的了解也还不够全面。因此，对DVT中的转录组、免疫和代谢特征进行全面分析，有助于发现新的分子标志物以及免疫性血栓形成背后的潜在调控机制。章节片段伦理审批、样本采集与RNA测序本研究使用的人类样本采集方案已获得福建医科大学附属协和医院伦理委员会的批准。所有参与者均签署了书面知情同意书，所有涉及人类样本的实验均遵循相关的伦理标准和实验指南进行。DVT组的外周血样本来自在福建医科大学附属协和医院接受治疗的DVT患者，而对照组的样本则来自……对DVT患者临床特征的全面分析为系统评估DVT患者的病理生理特征，我们对DVT组和健康对照组中的20项核心临床参数进行了综合分析。个体临床特征热图（图1A）显示，两组在整体临床表型层面存在明显差异。DVT患者表现出相对一致的异常临床特征，尤其是在与凝血功能相关的指标和系统性炎症标志物方面。讨论本研究通过整合多维度临床参数、外周血全转录组测序、免疫解析分析以及外部独立队列验证，系统阐述了与DVT发病和发展相关的免疫与代谢重塑特征。总体而言，我们不仅发现了具有较强区分能力的候选诊断标志物，还建立了涵盖四个层面的相互支撑的证据体系：临床……结论本研究系统构建了涵盖mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA的DVT分子图谱，确定了以F7、MTRNR2L10和SYT16为核心的候选诊断标志物组。此外，通过结合免疫解析分析、代谢途径评估以及外部独立队列验证，我们发现Neu_NETotic_Hub是DVT中关键的致病性中性粒细胞功能亚群。我们还发现，脂质代谢重编程以及活性氧生成的增加……缩写AISI：系统性炎症综合指数DSA：数字减影血管造影GEO：基因表达组学数据库GOG：基因本体论LEDVT：下肢深静脉血栓形成LASSO：最小绝对收缩和选择算法MAE：平均绝对误差MDSC：髓系来源的抑制细胞MPO：髓过氧化物酶MSigDB：分子特征数据库NEN：中性粒细胞弹性蛋白酶NETs：中性粒细胞外陷阱NLR：中性粒细胞与淋巴细胞比值OxLDL：氧化低密度脂蛋白PAD4：肽基精氨酸脱亚胺酶4PE：肺栓塞CRediT作者贡献说明明雪：可视化处理。陈忠庆：初稿撰写。郑学勋：监督指导。陈宇航：监督指导。张一鸣：监督指导。蔡权民：可视化处理。刘坤：可视化处理。施浩源：审稿与编辑、初稿撰写。关云标：审稿与编辑、正式分析、数据整理、概念构建。周亚东：审稿与编辑、监督指导、数据整理、概念构建。知情同意声明本研究已获得所有参与者的知情同意。机构审查委员会声明本研究遵循《赫尔辛基宣言》的要求进行，并已获得福建医科大学附属协和医院机构审查委员会的批准（方案编号2023KJT047，批准日期为2022年9月27日）。资助福建省自然科学基金（2023J01653）。利益冲突声明作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。致谢无。