射精特征对老虎（Panthera tigris ssp.）基因组资源库策略的影响

《Theriogenology》：The influence of ejaculate traits on strategies for genome resource banking in tigers (Panthera tigris ssp.)

　　

老虎物种生存计划已建立了一个基因组资源库（GRB），用于冷冻保存美国动物园管理的三个虎亚种（阿穆尔虎Panthera tigris altaica、苏门答腊虎P.t. sumatrae、马来虎P.t. jacksoni）所有成年雄性的精子。研究人员分析了从69个个体（阿穆尔虎n=32、苏门答腊虎n=23、马来虎n=14，年龄2-18岁，收集于2013-2023年）收集的104份射精样本。结果提供了表征当前种群雄性生殖特征的机会，并确定了单次采集的精子数量如何影响未来维持GRB的策略，考虑到当前人工授精（AI）、体外受精（IVF）和胚胎移植（ET）的成功率。精液通过电刺激采精法收集，进行分析并冷冻保存。每次射精的总精子数在不同亚种之间无差异（种群平均值=175.2±22.5×10⁶）。尽管大多数精子具有活力（种群平均值=67.1±2.2%），但形态正常精子的数量非常低（平均值=14.5±1.0%）。该正常精子百分比远低于先前对北美种群的研究。为使每个个体的遗传信息在GRB中得到充分代表，必须有足够的精子通过辅助生殖产生10个后代，研究人员估计如果使用腹腔镜输卵管AI（LO-AI），需要30次操作，需1.5亿个有活力精子。种群管理者必须计划在雄性生殖寿命期间进行频繁采集。此外，有必要进一步研究体外ART，以最大化所采集样本的潜力。

### 研究背景与问题
老虎（*Panthera tigris* ssp.）是动物园中备受关注的濒危物种。自20世纪80年代末至90年代初，早期研究指出雄性老虎能产生大量形态正常的精子，而近30年来相关生殖生物学和辅助生殖技术（ART）研究进展有限。2017年，老虎物种生存计划（SSP）开始为阿穆尔虎、苏门答腊虎和马来虎建立基因组资源库（GRB），但面临关键问题：当前圈养种群的射精特征是否仍与历史数据一致？单次采集的精子数量和质量能否满足GRB要求以通过ART（如人工授精AI、体外受精IVF/胚胎移植ET）产生足够后代？现有ART效率低下（AI成功率约10-16.7%，IVF/ET仅1次成功妊娠），使GRB策略制定面临挑战。为此，研究人员评估了美国动物园中69只雄性老虎的射精特征，并基于数据估算所需采集次数，以优化GRB保存策略。

### 研究内容与结论
研究人员分析了104份射精样本，发现每份射精平均总精子数为175.2×10⁶，活力平均67.1%，但形态正常比例仅14.5%，远低于历史研究（65-78%）。该低正常率与饮食中植物雌激素活性及遗传杂合度潜在降低相关。基于LO-AI需每次500万有活力精子，估算产生10个后代需30次操作，共需1.5亿有活力精子。然而，平均每只雄性冷冻后仅能获得约2340万有活力精子，因此需对同一雄性进行5-14次采集（取决于亚种）才能充分代表其遗传信息。当前每两年一次常规检查仅提供约7次采集机会，需在每次麻醉时进行采精。论文发表在《Theriogenology》，强调需改进ART效率并纳入体细胞保存作为补充。

### 主要关键技术方法
研究人员从美国48家动物园的69只老虎（阿穆尔虎32只、苏门答腊虎23只、马来虎14只，2013-2023年采集）中，通过电刺激采精法（标准程序）收集104份射精样本。样本经形态学评估（200个精子×1000倍油镜）、活力评分及冷冻保存（使用含蛋黄和甘油的TEST缓冲液，0.250ml塑料细管，液氮蒸汽法）。后续采用腹腔镜输卵管AI（LO-AI）所需精子数（每次500万有活力精子）估算GRB所需采集次数。

### 研究结果
**射精特征分析：** 每份射精总精子数范围0-1023.0×10⁶，种群平均值175.2±22.3×10⁶，亚种间无显著差异。但苏门答腊虎射精体积（8.29±0.98 ml）显著高于阿穆尔虎（4.80±0.49 ml）和马来虎（5.23±0.67 ml）。活力平均67.1±2.2%，形态正常比例仅14.5±1.0%，主要异常为保留胞浆滴（30.1%）、弯尾（25.1%）和弯中段伴保留胞浆滴（15.7%）。季节和年龄对主要指标（总精子数、正常比例、活力）无显著影响（P>0.05）。15-18岁雄性（n=12）平均每次射精148.7±47.1×10⁶精子，活力65.4%，正常形态10.4%。

**冷冻保存与GRB策略：** 14份样本（<500万有活力精子）和2份尿污染样本被丢弃，10份用于AI，77份（74%）成功冷冻，平均每只雄性获12支细管（范围1-46）。冷冻后活力约20%，但所有样本能受精家猫卵母细胞并支持早期胚胎发育。基于LO-AI需每次500万有活力精子，估算每只雄性需冷冻7500万有活力精子才能确保产生10个后代（30次操作）。然而，仅1.9%的采集样本（2份，均来自阿穆尔虎）单次达到该阈值。平均每只雄性单次射精可获175×10⁶个精子，冷冻后仅约2340万有活力，因此需对同一雄性进行5（苏门答腊虎）至14（马来虎）次采集（表2）。

**技术比较与建议：** 经宫颈AI（TC-AI）需每次1-5亿有活力精子，且仅新鲜精子有效；腹腔镜输卵管AI（LO-AI）需500万；IVF/ET需更少（单次约100万）。综合考虑物流和精子利用率，LO-AI是最佳折中方案。此外，建议采用更简便的导管采精法或超速冷冻技术，以增加采集频率。

### 讨论与结论
讨论指出，当前圈养种群精子形态正常率显著低于历史研究，可能与饮食植物雌激素或遗传多样性下降有关，需进一步分子遗传分析。GRB需确保每只雄性有足够样本以通过ART产生10个后代，但当前ART效率低下（LO-AI约10%妊娠率），导致所需采集次数远超常规。因此，必须制定计划在雄性生殖寿命内定期采集（每两年一次），并优先改进AI和IVF/ET效率。此外，体细胞（如成纤维细胞）的保存可作为后备方案，因其易于采集和冷冻，可通过体细胞核移植（SCNT）或干细胞技术生产配子，但目前仅在小型猫科动物中成功。结论强调：对于雄性，应以精子冷冻保存为主，体细胞为备份；对于雌性，体细胞保存是目前唯一可行的方法。未来应优化卵母细胞玻璃化冷冻和胚胎培养技术，同时推动ART效率提升以最大化GRB长期存储潜力。