肿瘤微环境相关预后基因 TIGIT 促进食管癌细胞恶性表型

《Translational Oncology》：The tumor-microenvironment-associated prognostic gene TIGIT promotes malignant phenotypes in esophageal carcinoma

　　

背景：既往研究表明肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）相关标志物与肿瘤预后相关，但少见关于可切除食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）中肿瘤细胞表面生物标志物（如CD8、TIM3、PD?L1、LAG3、CD163及TIGIT）预后价值的研究。方法：研究人员回顾性分析浙江省肿瘤医院接受完全性切除的69例ESCC患者标本，采用多重免疫荧光组织化学评估CD8、TIM3、PD?L1、LAG3、CD163和TIGIT在肿瘤及免疫微环境中的表达及其与临床结局的关系；以三色免疫荧光验证TIGIT在ESCC组织中的表达；通过RNA?seq、实时荧光定量PCR（qRT?PCR）、蛋白质印迹（Western blot, WB）、CCK?8法、Transwell小室实验及流式细胞术探讨TIGIT功能。结果：中位随访47.7个月，高表达率依次为CD8（52.2%）、TIM3（29.0%）、PD?L1（17.4%）、LAG3（24.6%）、TIGIT（20.3%）及CD163（14.5%）；中位无病生存期（disease?free survival, DFS）为17.4个月，总生存期（overall survival, OS）为26.8个月；TIGIT高表达与较短DFS及OS相关；按TIGIT/PAN?CK比值分层显示肿瘤细胞TIGIT高表达为不良预后指标；功能实验表明敲低TIGIT可减少ESCC细胞迁移、侵袭及增殖，并使细胞周期分布改变（S期蓄积）；RNA?seq提示细胞因子?受体相互作用及JAK?STAT信号轴参与TIGIT介导的功能。结论：TIGIT与PD?L1及CD163同为可切除ESCC潜在预后标志物；TIGIT不仅表达于免疫细胞，亦表达于ESCC肿瘤细胞，提示其可作为生物标志物及治疗靶点；尚需进一步机制研究阐明下游信号通路并验证TIGIT在ESCC中的作用机制。

论文解读——《The tumor?microenvironment?associated prognostic gene TIGIT promotes malignant phenotypes in esophageal carcinoma》发表于《Translational Oncology》

研究背景

食管癌（esophageal cancer, EC）全球发病率居第7位、死亡率居第6位，其中食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）约占87%，尤以中国高发。即便行根治性切除，ESCC患者5年生存率仍不足40%，亟需新的预后评估手段与治疗靶点。免疫检查点分子如CD8、TIM3（T?cell immunoglobulin and mucin domain 3）、PD?L1（programmed death?ligand 1）、LAG3（lymphocyte activation gene 3）、CD163及TIGIT（T?cell Ig and ITIM domain）在肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）中的作用备受关注，但上述标志物在可切除ESCC中的预后价值及TIGIT在肿瘤细胞本身的自主功能尚不清楚，因此研究人员开展此项研究。

主要关键技术方法

研究人员回顾性收集浙江省肿瘤医院69例接受根治性切除、有完整临床随访资料的ESCC患者甲醛固定石蜡包埋（formalin?fixed paraffin?embedded, FFPE）组织标本，制作组织微阵列（tissue microarray, TMA）。采用Opal多重免疫荧光组织化学（multiplex immunofluorescence histochemistry）及三色免疫荧光检测CD8、TIM3、PD?L1、LAG3、CD163和TIGIT在肿瘤巢与免疫细胞的表达，并以PAN?CK（pan?cytokeratin）区分肿瘤细胞计算TIGIT/PAN?CK比值。使用ESCC细胞系KYSE?30和KYSE?50进行TIGIT siRNA敲低，通过qRT?PCR和Western blot验证敲低效率，CCK?8法检测增殖，Transwell迁移及Matrigel侵袭实验检测迁移和侵袭能力，流式细胞术检测细胞周期与凋亡。对敲低组与对照组行RNA?seq并进行KEGG通路富集分析。临床随访数据采用Kaplan?Meier法绘制生存曲线，Cox比例风险模型进行单因素及多因素回归分析。

研究结果

Patient characteristics

研究最终纳入69例ESCC患者（男48例，占69.6%；中位年龄60岁），中位随访47.7个月。高表达率分别为CD8 52.2%、TIM3 29.0%、PD?L1 17.4%、LAG3 24.6%、TIGIT 20.3%、CD163 14.5%。中位DFS为17.4个月，中位OS为26.8个月。

Associations between biomarker expression and clinicopathological characteristics

高PD?L1表达与更深浸润深度及更晚临床分期相关（均p＝0.028）；高LAG3表达与脉管癌栓相关（p＝0.027）；高TIM3表达与神经周围浸润相关（p＝0.006）。标志物间相关性分析显示CD8与TIM3、PD?L1、LAG3显著正相关；TIM3、PD?L1、LAG3、CD163彼此呈强正相关，而TIGIT与上述其他免疫标志物无显著相关。

Analysis of biomarker levels in the tumor microenvironment and their impact on prognosis

高PD?L1（DFS 14.1 vs 19.8个月，p＝0.049）、高CD163（DFS 11.1 vs 19.8个月，p＝0.028）及高TIGIT（DFS 13.8 vs 19.3个月，p＝0.047）均与较短DFS显著相关；高TIGIT提示OS缩短趋势（21.7 vs 27.7个月，p＝0.052）。TIM3⁺TIGIT⁺共表达者DFS更短（16.9 vs 32.7个月，p＝0.046）；PD?L1⁺LAG3⁺、PD?L1⁺CD163⁺、CD163⁺TIGIT⁺共表达也与较短DFS相关。

Univariate and multivariate analysis of survival

单因素Cox分析显示CD163⁺、TIGIT⁺、TIM3⁺LAG3⁺、CD163⁺TIGIT⁺与较差DFS相关（p≤0.05）；多因素分析中这些因素未保留独立显著性。OS单因素分析中晚期临床分期及CD8⁺LAG3⁺与较差OS有关；多因素分析确定淋巴结转移（HR 1.512, 95% CI 1.109–2.060, p＝0.009）及TIGIT高表达（HR 1.969, 95% CI 1.009–3.841, p＝0.047）为OS独立不良预后因素。

Validation of the TIGIT/PanCK ratio as a prognostic biomarker

按TIGIT与PAN?CK平均荧光强度比值分层，高TIGIT/PAN?CK比值患者DFS（10.7 vs 19.8个月，p＝0.002）及OS（15.0 vs 31.1个月，p＜0.001）均显著更差，证实肿瘤细胞固有TIGIT表达具不良预后价值。

Analysis of TIGIT expression in cytotoxic T cells and its prognostic implications

在CD8⁺T细胞区室内高TIGIT表达亦与较短DFS相关（13.3 vs 25.2个月，p＝0.007）；CD8⁺T细胞中PD?L1⁺TIGIT⁺共表达者DFS更短（p＝0.050）。

TIGIT knockdown reduces the migration, invasion, and proliferation of ESCC cells and alters cell cycle distribution

siRNA敲低TIGIT后，KYSE?30细胞中TIGIT mRNA及蛋白显著下调；Transwell实验显示迁移及侵袭能力显著降低；CCK?8示增殖受抑；流式细胞术示G₀/G₁期细胞比例下降，S期及G₂/M期蓄积，凋亡率无显著变化；RNA?seq提示差异基因富集于细胞因子?受体相互作用（cytokine?receptor interaction）及JAK?STAT信号通路。

讨论与结论

研究人员在可切除ESCC中发现PD?L1、CD163及TIGIT高表达与不良DFS相关，且TIGIT是OS的独立预后危险因素。TIGIT不仅表达于肿瘤浸润免疫细胞，也表达于ESCC肿瘤细胞本身，肿瘤细胞内TIGIT/PAN?CK高比值预示更差预后。功能实验首次证明肿瘤细胞固有TIGIT可促进ESCC细胞增殖、迁移及侵袭并影响细胞周期进程，提示TIGIT除经典免疫检查点作用外还有非免疫依赖的促癌功能。该发现为ESCC预后分层提供了新标志物，并为抗TIGIT联合抗PD?L1治疗策略提供了理论依据。

结论原文翻译：本研究中，研究人员确定TIGIT、PD?L1及CD163表达是无病生存期（DFS）显著不良预后因素，且TIGIT是总生存期（OS）关键独立预测因子。值得注意的是，TIGIT不仅表达于免疫细胞，亦表达于ESCC肿瘤细胞，强调其作为ESCC生物标志物及治疗靶点的潜力。功能实验进一步揭示TIGIT调控肿瘤细胞迁移、侵袭及增殖并改变细胞周期分布，提示TIGIT在ESCC生物学中可能具有非免疫依赖作用，有待进一步机制验证。