基于先进小RNA测序技术的宫颈癌尿液微小核糖核酸标志物的发现与分析评估

《Translational Oncology》：Discovery and analytical assessment of urinary miRNA biomarkers for cervical cancer using advanced small RNA sequencing

　　

宫颈癌主要由高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus, hrHPV）持续感染引起，hrHPV感染可改变宿主核糖核酸（RNA）表达，包括调控性微小核糖核酸（microRNA, miRNA）。由于尿液正成为癌症检测的便捷生物来源，研究人员评估了尿液miRNA作为宫颈癌非侵入性生物标志物的可行性。研究人员优化了全尿及尿液组分中的miRNA分离方法，采用商业RNA提取试剂盒、spike-in对照及数字纳米板聚合酶链式反应（digital nanoplate PCR, dPCR）进行评估。在确定最优条件后，采用IsoSeek小RNA测序技术对宫颈癌患者（n=20）和年龄匹配对照（n=20）的尿液miRNA表达谱进行分析。之后，通过逆转录-定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）对差异表达候选分子进行分析验证。结果显示，Norgen RNA分离试剂盒应用于全尿时可提供最稳健的miRNA回收。测序鉴定发现宫颈癌患者尿液中hsa-miR-143^-3p和hsa-miR-204^-3p水平显著改变。该miRNA比值在利用IsoSeek检测时显示出强判别性能（AUC=0.93），并在同一队列中经RT-qPCR分析后仍保持稳健（AUC=0.84）。这些发现支持尿液miRNA分析用于非侵入性生物标志物发现的可行性，并突出hsa-miR-143^-3p/hsa-miR-204^-3p比值作为宫颈癌检测候选标志物的潜力。

宫颈癌是全球女性第四大癌症死亡原因，2022年超过66万女性确诊，34.5万人死亡，其中多数死亡病例发生在中低收入国家。尽管基于人群的筛查显著降低了宫颈癌发病率，但随着接种疫苗女性进入筛查项目以及宫颈阴道自采样日益普及，现有分流策略暴露出不适应性——自采样排除了细胞学分流的可能性，亟需替代性分流方案。与此同时，筛查参与率亦是影响筛查效果的关键因素，而尿液等微创样本因患者友好、可居家采集而备受青睐，其中尿液尤为女性所偏好。既往研究表明尿液人乳头瘤病毒（HPV）检测具有价值，但尿液分流检测研究有限。研究人员的前期工作已证实尿液DNA甲基化检测对宫颈（前）癌具有良好灵敏度，但仍存改进空间。

微小核糖核酸（miRNA）是在转录后水平调控基因表达的小分子非编码RNA。越来越多的证据表明，HPV感染及宫颈癌发生过程中存在miRNA失调，使其成为宫颈（前）癌诊断和风险分层的潜在生物标志物。鉴于miRNA在体液中的稳定性，研究人员假设其可作为尿液中检测宫颈癌的非侵入性标志物。然而，从尿液等液体活检样本中分离和分析miRNA仍具挑战性，不同研究采用的尿液起始材料各异，包括尿上清、尿胞外囊泡或过滤尿液等，但缺乏针对所有尿液组分（全尿、上清和沉淀）最优分离方法的共识。本研究旨在评估尿液miRNA作为宫颈癌生物标志物的可行性，比较四种miRNA分离方法，并采用测序和PCR技术进行评估。研究利用专为小RNA测序建立、针对低输入样本优化miRNA检测的IsoSeek方案，识别最有效的尿液miRNA分离方法，并证明尿液miRNA作为宫颈癌检测标志物的潜力。

研究样本队列来源于两个项目：健康对照尿液来自URIC生物库（系列1：n=7用于技术优化；系列2：n=25作为癌症样本的年龄匹配对照），宫颈癌患者尿液来自SOLUTION 1研究（n=20，经组织病理学确诊且治疗前采集）。所有参与者均签署知情同意书，经阿姆斯特丹自由大学医学中心伦理委员会批准。样本采集后邮寄至实验室，离心获取全尿、上清和沉淀三个组分，于-20°C保存。

关键技术方法主要包括：第一，Norgen总RNA纯化试剂盒（用于全尿miRNA分离）、miRNeasy迷你试剂盒、miRNeasy血清/血浆高级试剂盒及TRIzol试剂四种方法的系统比较，结合cel-miR-76^-3p spike-in对照和dPCR评估；第二，基于IsoSeek优化流程的小RNA测序，采用NEBNext Small RNA文库制备试剂盒、定制5′-5N和3′-5N接头、BluePippin自动凝胶电泳系统进行文库大小选择，在Illumina NextSeq2000平台进行双向端测序（PE 50 bp）；第三，sRNAbench工具进行接头修剪和miRBase v22注释，DESeq2进行标准化和差异表达分析；第四，TaqMan miRNA反转录试剂盒进行多重RT-qPCR验证，采用ViiA7实时PCR系统检测；第五，QIAcuity dPCR系统用于精确定量。

**不同尿液组分中miRNA分离方法的性能差异**

研究人员首先系统比较了四种miRNA分离方法在七种健康对照尿液样本不同组分中的表现。通过dPCR从四个方面评估：总miRNA产量、PCR抑制情况、spike-in产量和内源性miRNA产量。结果显示，对于全尿和上清组分，Norgen试剂盒的miRNA产量显著高于TRIzol和miRNeasy_sp（q<0.10）；对于沉淀组分，miRNeasy_sp表现优于TRIzol（q<0.10）。miRNA/RNA比值分析表明，Norgen在全尿和上清中提供的miRNA相对比例更高（q<0.10）。spike-in cel-miR-76^-3p定量显示，Norgen从全尿中回收量显著高于其他方法（q<0.05）；RT-spike-in cel-miR-54^-3p检测显示Norgen来源样本在所有三个组分中均表现出最低PCR抑制（q<0.05）。内源性低丰度（hsa-miR-30e^-3p）、中等丰度（hsa-miR-26b^-5p）和高丰度（hsa-let-7b^-5p）miRNA的dPCR定量进一步验证了上述方法性能排序。该部分结论表明，Norgen适用于全尿和上清miRNA分离，miRNeasy_sp适用于沉淀组分。

**基于测序和PCR的宫颈癌尿液miRNA标志物评估**

采用Norgen分离的全尿样本，研究人员对20例健康对照和20例宫颈癌患者进行IsoSeek小RNA测序。尽管个体间小分子RNA组成差异显著（miRNA占比20%-90%），但每例样本均可检测到超过190种成熟miRNA（范围117-537）。经过滤后237种成熟miRNA纳入差异分析，鉴定出19种显著上调和21种显著下调的miRNA。其中，hsa-miR-143^-3p显著上调（FDR<0.0001），hsa-miR-204^-3p显著下调（FDR<0.0001）。ROC分析显示，hsa-miR-143^-3p单独AUC为0.71（95%CI 0.55-0.88），hsa-miR-204^-3p单独AUC为0.86（95%CI 0.75-0.97），而二者比值（hsa-miR-143^-3p/hsa-miR-204^-3p）的判别性能最优，AUC达0.93（95%CI 0.83-1.00）。RT-qPCR在同一样本中验证了这一发现：hsa-miR-143^-3p在癌症中显著上调，hsa-miR-204^-3p呈非显著性下调趋势，Ct比值在癌症样本中显著降低（p<0.001），ROC的AUC为0.84（95%CI 0.70-0.97），高于任一miRNA单独表现。

讨论部分，研究人员首先强调方法学比较的意义：不同尿液组分需要匹配合适的分离方法，Norgen在全尿中的低抑制和高产量使其成为该类型样本的稳健选择，这与既往报道一致，为尿液miRNA研究提供了方法学基准。IsoSeek首次应用于宫颈癌背景下的尿液miRNA测序分析，其发现驱动的优势在于无需预先假设相关标志物，特别适用于尿液等低丰度样本的全面表征。

关于生物学发现，hsa-miR-143^-3p和hsa-miR-204^-3p在宫颈癌生物学中具有已知作用：前者与细胞增殖和侵袭等致癌过程相关，后者作为肿瘤抑制因子其下调与多种癌症不良预后相关。值得注意的是，尿液中hsa-miR-143^-3p的上调与组织中的下调报道形成对比，可能反映了癌症相关细胞的选择性分泌或循环肿瘤来源外泌体的独特生物学。比值策略优于单一标志物，因其可技术归一化变异并放大生物学差异。研究同时指出样本间miRNA浓度变异较大的问题，这既反映宫颈细胞miRNA表达变异，也反映不同样本中脱落细胞数量的差异，进一步支持测序策略的必要性。

临床应用方面，居家尿采集的便捷性结合miRNA的稳定性，使该方法尤其适合资源有限地区。与HPV DNA检测、HPV基因分型或DNA甲基化等现有策略整合，可能提高早期检出率。但向临床转化需满足：标准化前处理协议、miRNA分离定量共识指南、技术参数全面报告，以及大规模前瞻性验证研究，这符合MUMIE报告框架的要求。

研究局限性包括：样本量较小（20对匹配样本）；发现和验证在同一队列进行可能导致诊断性能估计过于乐观；未纳入hrHPV阳性无癌或癌前病变等中间群体；尿液miRNA谱可能受多种生物学前分析变量影响。未来需在更大样本量、包括癌前病变患者的队列中进一步验证。

研究结论为：本项技术优化和可行性研究为开发尿液miRNA作为宫颈癌及其他泌尿生殖道癌症非侵入性生物标志物奠定了基础。通过证明基于测序的标志物发现的可能性并鉴定出有前景的候选标志物，该研究为支持尿液液体活检应用的证据体系做出了贡献。