Circ_0008777通过与PC4及miR-185–3p相互作用上调c-Myc表达促进头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC）进展

《Translational Oncology》：Circ_0008777 promotes head and neck squamous cell carcinoma progression by elevating c-Myc expression levels via interacting with PC4 and miR-185–3p

　　

摘要：环状RNA（circular RNAs, circRNAs）已被证实是肿瘤进展的关键调控分子，但其在头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）中的作用仍待阐明。AURKA基因在HNSCC中常发生扩增与激活。本研究探讨来源于AURKA第3–6号外显子的circ_0008777在HNSCC中的表达模式与功能。研究人员通过体外及体内实验评估了circ_0008777的生物学功能及其与正性辅因子4（positive cofactor 4, PC4）和miR-185–3p的相互作用。结果显示，circ_0008777在HNSCC组织及细胞系中表达上调，且与侵袭性临床特征相关。敲低circ_0008777显著抑制HNSCC细胞体外增殖与迁移，并在体内抑制肿瘤生长，而过表达circ_0008777则产生相反效应。机制上，circ_0008777可结合PC4以增强c-Myc转录；生物信息学分析显示PC4在HNSCC患者中高表达且其高表达与总生存期缩短负相关，PC4敲除可抑制HNSCC细胞增殖与迁移。此外，circ_0008777可通过microRNA海绵机制吸附miR-185–3p，解除miR-185–3p对c-Myc mRNA的抑制。进一步发现，c-Myc过表达可逆转circ_0008777敲低对细胞迁移与增殖的抑制作用。综上，circ_0008777通过PC4依赖的转录激活及miR-185–3p海绵作用双重途径上调c-Myc表达，从而促进HNSCC进展，提示其有望成为HNSCC的潜在治疗靶点。

论文解读：Circ_0008777通过PC4及miR-185–3p介导c-Myc上调促进头颈部鳞状细胞癌进展

一、研究背景与目的意义

头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC）是常见的恶性肿瘤，超过60%患者确诊时已属晚期且预后差，亟需发掘新的早期诊断标志物与治疗靶点。环状RNA（circular RNA, circRNA）因其闭合环状结构具有抗RNase R降解的稳定性，在肿瘤增殖、转移及耐药等过程中发挥重要作用，但circRNA在HNSCC中的具体调控机制尚不清楚。AURKA（aurora kinase A）是已知的原癌基因，在HNSCC中高表达，转录组测序提示其来源的一个circRNA——circ_0008777（hsa_circ_0008777，由AURKA外显子3–6环化形成）在HNSCC组织中高表达，但其功能未知。中山大学附属第三医院耳鼻咽喉头颈外科Weixing Liu、Zhiyuan Wang、Pei Li、Yue Liu、Jia Chen、Zhi Shi、Hui Liu及Jin Ye开展此项研究，旨在明确circ_0008777在HNSCC中的表达特征、生物学功能及分子机制，证实circ_0008777通过结合正性辅因子4（Positive Cofactor 4, PC4/SUB1）及吸附miR-185–3p双重途径上调原癌基因c-Myc促进HNSCC进展，为HNSCC提供潜在诊疗靶点。该论文发表于《Translational Oncology》。

二、主要关键技术方法概述

研究人员收集中山大学附属第三医院2019–2024年60例初治HNSCC患者的癌组织及配对癌旁正常上皮组织。采用RNase R消化实验与放线菌素D（actinomycin D）处理验证circ_0008777的环状结构及稳定性；荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）与细胞核质分离鉴定亚细胞定位；构建shRNA慢病毒敲低及过表达质粒转染HNSCC细胞系（Cal27、Tu212、Fadu），利用CRISPR/Cas9技术构建PC4敲除稳转株；通过CCK-8、克隆形成、划痕愈合及Transwell实验检测细胞增殖与迁移能力；裸鼠皮下成瘤模型评估体内致瘤性；RNA pull-down联合质谱鉴定互作蛋白，RNA免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation, RIP）验证circ_0008777与PC4及Argonaute 2（AGO2）的结合；染色质免疫沉淀结合qPCR（Chromatin Immunoprecipitation-qPCR, ChIP-qPCR）检测PC4与c-Myc启动子结合情况；双荧光素酶报告基因实验验证circ_0008777与miR-185–3p的直接结合；Western blot及qPCR检测c-Myc及相关分子表达；无标定量蛋白质组学分析差异蛋白并进行KEGG通路富集；ROC曲线评估诊断价值，统计学采用t检验或ANOVA分析。

三、研究结果

Circ_0008777 is overexpressed in HNSCC tissues（circ_0008777在HNSCC组织中过表达）

Sanger测序确认环化位点；divergent引物可从cDNA而非基因组DNA（gDNA）扩增circ_0008777，且抵抗RNase R降解，证实其为环状RNA。亚细胞分级与FISH显示circ_0008777定位于细胞核与细胞质，放线菌素D处理证实其比线性AURKA mRNA更稳定。qPCR结果显示circ_0008777在HNSCC细胞系（Cal27、Tu212、Fadu）及癌组织中显著高表达，高表达与T分期（T3–4 vs T1–2）、N分期（N1–3 vs N0）及临床分期（III–IV vs I–II）正相关；ROC曲线下面积（AUC）为0.67，具有一定鉴别诊断价值。

Circ_0008777 promotes HNSCC cell proliferation and migration in vitro（circ_0008777促进HNSCC细胞体外增殖与迁移）

敲低circ_0008777显著降低Cal27、Tu212及Fadu细胞活力（CCK-8）与克隆形成能力，抑制划痕愈合与Transwell迁移；过表达circ_0008777则促进上述表型，表明circ_0008777作为癌基因增强HNSCC细胞增殖与迁移。

Circ_0008777 promotes the tumorigenesis of HNSCC cells in vivo（circ_0008777促进HNSCC细胞体内成瘤）

裸鼠皮下移植瘤模型中，circ_0008777敲低组肿瘤体积与重量显著减小，过表达组增大；移植瘤中circ_0008777表达与干预一致。Tu212细胞circ_0008777敲低后无标定量蛋白质组学鉴定到342个差异蛋白（138上调、204下调），KEGG富集显示下调蛋白显著富集于泛素介导的蛋白酶解、细胞周期、代谢通路及铂类耐药通路，提示circ_0008777促进体内HNSCC增殖。

Circ_0008777 can recruit PC4 to promote c-Myc transcription in HNSCC cells（circ_0008777招募PC4促进c-Myc转录）

RNA pull-down联合质谱筛选到circ_0008777互作蛋白PC4，Western blot及RIP实验验证circ_0008777与PC4直接结合，且结合区域为PC4的共激活结构域（氨基酸22–91）。circ_0008777敲低不影响PC4蛋白水平，但降低c-Myc蛋白及mRNA水平；PC4敲除同样降低c-Myc表达。ChIP-qPCR显示circ_0008777敲低削弱PC4与c-Myc基因启动子的结合。PC4敲除不影响TAF1、POLR2A、FOS mRNA，仅PCNA mRNA降低，说明c-Myc下调为特异性调控事件。表明circ_0008777通过结合PC4并促进PC4募集至c-Myc启动子以增强c-Myc转录。

PC4 promotes HNSCC progression（PC4促进HNSCC进展）

生物信息学分析显示PC4在HNSCC中高表达且与总生存期不良负相关；PC4敲除显著抑制Cal27与Tu212细胞的增殖（CCK-8、克隆形成）与迁移（Transwell、划痕愈合），证实PC4本身具促HNSCC恶性表型作用。

Circ_0008777 acts as a sponge of miR-185–3p（circ_0008777作为miR-185–3p的海绵）

AGO2-RIP证实circ_0008777进入AGO2复合物参与miRNA海绵功能；数据库预测并与HNSCC中下调miRNA取交集锁定miR-185–3p。circ_0008777敲低上调细胞内miR-185–3p，过表达下调之；双荧光素酶报告实验显示miR-185–3p mimic仅抑制含野生型结合位点的circ_0008777报告载体活性，突变结合位点则无影响，证实直接结合。miR-185–3p mimic转染降低c-Myc蛋白水平，说明circ_0008777通过海绵吸附miR-185–3p解除其对c-Myc mRNA的抑制。

Circ_0008777 can accelerate HNSCC progression via c-Myc（circ_0008777通过c-Myc加速HNSCC进展）

在circ_0008777敲低细胞中过表达c-Myc可回补细胞增殖与迁移受抑表型，并恢复CDK4 mRNA水平；circ_0008777表达与c-Myc mRNA正相关。敲低circ_0008777不影响宿主基因AURKA蛋白水平，MG132处理排除蛋白降解影响，确认circ_0008777通过提升c-Myc合成发挥促癌作用，c-Myc为该轴核心效应分子。

四、讨论与结论翻译

讨论部分总结：本研究鉴定到AURKA来源的新circRNA——circ_0008777在HNSCC中高表达并与不良临床特征相关。功能实验证实其促HNSCC增殖迁移。机制上揭示双重调控模式：核内circ_0008777结合PC4共激活结构域，促进PC4结合c-Myc启动子增强转录；胞质内circ_0008777作为miR-185–3p海绵解除其对c-Myc的抑制，两条途径共同上调c-Myc。PC4在HNSCC中首次被报道高表达且促癌。研究拓展了c-Myc的circRNA调控网络，circ_0008777也可能通过miR-185–3p参与铂类耐药，值得后续探究。

结论（翻译）：研究人员的数据表明，circ_0008777在HNSCC组织中表达上调，其高表达与较差的临床病理特征相关；机制上，circ_0008777通过与PC4相互作用及海绵吸附miR-185–3p上调c-Myc表达，从而促进HNSCC进展，提示circ_0008777可作为HNSCC潜在的候选治疗靶点。