尿酸作为CO3•?清除剂和SOD-1与OGG1酶调节剂：来自DFT、分子对接和分子动力学的见解

《Antioxidants》：Urate as a CO3?? Scavenger and Regulator of SOD-1 and OGG1 Enzymes: Insights from DFT, Molecular Docking, and Molecular Dynamics

　　

采用量子化学计算研究了尿酸（urate）——一种丰富的人体血浆抗氧化剂——在预防由碳酸根自由基阴离子（CO₃^•?）引起的氧化损伤方面的效力。研究人员研究了CO₃^•?/CO₃^2?和urate^?/urate^•对的微水合作用对单电子氧化过程热力学和动力学的影响。根据微水合程度，估算的单电子转移速率常数在2.0–7.3 × 10⁹ M^?1 s^?1范围内，与实验值1.3 × 10⁹ M^?1 s^?1吻合良好。利用垂直脱附能和电子亲和能的建模，单电子转移的驱动力揭示了urate(H₂O)₆^?和CO₃(H₂O)₉^•?簇是水中最可能存在的物种。分子对接揭示了urate与SOD1（铜锌超氧化物歧化酶1）催化口袋的有利相互作用。urate与SOD1阴离子活性中心的结合比参考抑制剂LSC-1更强，表明其具有阻止HCO₃^?支持的CO₃^•?形成的效力。相反，已知的OGG1（8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶1）抑制剂TH13264显示出比urate更强的结合，表明urate对DNA修复酶催化口袋的亲和力较弱。分子动力学数据表明，urate结合不会使SOD1或OGG1不稳定。鉴于越来越多的证据表明氧化应激的主要来源可能是CO₃^•?，而不是通常假设的羟基自由基HO^•，所获得的结果表明血浆具有内在能力来抵抗这种选择性、温和氧化剂诱导的氧化应激。而对于非选择性、高反应活性的HO^•，这种能力在体内不存在。

尿酸作为CO₃^•?清除剂与SOD1和OGG1酶调节剂的DFT、分子对接及分子动力学研究解读

**研究背景与目的**

活性氧和氮物种（ROS/RNS）的过度产生是氧化应激的主要成因。长期以来，羟基自由基（HO^•）被认为是氧化应激的主要来源，但由于其极高的反应活性和非选择性，体内无法通过直接清除实现有效抗氧化。近年来越来越多的证据表明，在生理条件下，碳酸根自由基阴离子（CO₃^•?）比HO^•更可能是氧化应激的主要来源。CO₃^•?是比HO^•更温和的氧化剂，能够扩散至远离产生位点的地方选择性氧化生物分子，且理论上可被血浆抗氧化剂直接清除。尿酸（urate）作为人体血浆中浓度最高（150–450 μM）的抗氧化剂，贡献了血浆总抗氧化能力的40–55%，但其清除CO₃^•?的具体机制及对相关酶的调控作用尚未完全阐明。此外，超氧化物歧化酶1（SOD1）在过氧化氢（H₂O₂）和碳酸氢根（HCO₃^?）存在下可表现过氧化物酶活性，产生CO₃^•?，而DNA修复酶8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶1（OGG1）是治疗氧化性DNA损伤相关疾病的重要靶点。因此，研究人员开展此项研究，旨在从理论上评估urate直接清除CO₃^•?的效力，并探究urate与SOD1及OGG1的相互作用模式及其对酶功能的影响。

**主要技术方法**

研究人员采用了以下关键技术方法：（1）密度泛函理论（DFT）计算，使用M06-2X泛函和6-311++G(d,p)基组，结合SMD溶剂模型处理水环境，优化urate和CO₃^•?的微水合簇结构；（2）基于Marcus理论和过渡态理论（TST），利用Eyringpy程序计算单电子转移（SET）反应的热力学参数（反应吉布斯自由能Δ_rG）和动力学参数（速率常数kTST及表观速率常数k_app），并考虑pH 7.4下的摩尔分数；（3）分子对接分析，使用AutoDock Tools 1.5.7和AutoDock 4.2.6，将urate对接到SOD1（PDB ID: 1CB4）和OGG1（PDB ID: 8BVX）的活性位点，评估结合自由能和相互作用模式；（4）分子动力学（MD）模拟，使用AMBER 22软件包和ff14SB力场，对apo形式和urate结合的SOD1和OGG1进行150 ns的模拟，分析均方根偏差（RMSD）、回转半径（Rg）和均方根波动（RMSF）以评估结构稳定性。无样本队列来源，为纯理论计算研究。

**研究结果**

**1. 构象分析（Conformational Analysis）**
研究人员通过对urate(H₂O)_n^?（n=3, 6）和CO₃(H₂O)_n^•?（n=4, 6, 9, 12, 15, 24）簇进行全几何优化和频率计算，确定了最低能量构象。urate(H₂O)₃^?和urate(H₂O)₆^?簇通过氢键网络稳定，水合能（E_hydr）为负值表明水合自发。CO₃^•?簇的全局最低能量结构取自先前文献并在当前理论水平下重新优化。

**2. 尿酸簇清除CO₃^•?簇效能的估算（Estimation of Urate(H₂O)_n^? Cluster Potency in the Scavenging of the CO₃(H₂O)_n^•? Cluster）**
共模拟了28个SET反应。所有反应在热力学上可行（Δ_rG < 0），kTST均大于扩散极限。通过分析CO₃^•?簇的绝热电子亲和能（AEA）与log kTST的强相关性（r≥0.966），以及urate簇的垂直脱附能（VDE）与log kTST的相关性（r≤-0.971），研究人员确定了CO₃(H₂O)₉^•?和urate(H₂O)₆^?簇为生理pH下最可能存在的物种。两者间的SET反应为扩散控制，估算的速率常数$\$\backslash hat\{k\}\$$为7.3 × 10⁹ M^?1 s^?1，与实验值1.3 × 10⁹ M^?1 s^?1吻合良好。将urate的清除效力与α-生育酚、α-CEHC、没食子酸盐和Trolox进行比较，发现urate的清除能力强于α-生育酚和没食子酸盐，与α-CEHC和Trolox相当，但后两者在血浆中浓度极低或为合成化合物。

**3. 尿酸在SOD1和OGG1蛋白不同位点的分子对接研究（Molecular Docking Study of Urate in Different Positions of the SOD1 and OGG1 Proteins）**
分子对接显示，urate与SOD1的结合自由能为-5.25 kcal mol^?1（抑制常数K_i = 0.14 mM），与参考抑制剂LSC-1（-3.62 kcal mol^?1）相比结合更强。urate与SOD1活性位点中的关键残基（如ARG 141、HIS 118）形成氢键，并伴有π-阴离子和π-σ相互作用。urate与OGG1的结合自由能为-3.99 kcal mol^?1（K_i = 1.19 mM），弱于已知抑制剂TH13264（-7.44 kcal mol^?1），表明urate对OGG1的亲和力较低。研究人员推测urate可能通过占据SOD1的阴离子结合位点（ARG 141），抑制HCO₃^?依赖的CO₃^•?生成。

**4. 尿酸在SOD1和OGG1蛋白不同位点的分子动力学研究（Molecular Dynamics Study of Urate in Different Positions of the SOD1 and OGG1 Proteins）**
150 ns的MD模拟结果表明，urate结合后SOD1和OGG1的骨架RMSD值均略有降低（SOD1: 2.55±0.70 ?降至2.50±0.71 ?；OGG1: 2.61±0.58 ?降至2.44±0.53 ?），表明未引起显著构象扰动。回转半径（Rg）仅显示细微变化（SOD1轻微增大；OGG1几乎不变），说明整体紧密度保持。RMSF分析显示，SOD1的局部波动轻微增加（1.38±1.14 ?增至1.47±1.22 ?），而OGG1的波动降低（1.77±1.62 ?降至1.56±1.21 ?），提示urate结合对OGG1有稳定化作用。对urate与ARG 141的相互作用进行额外分析，发现氢键占有率和接触持久性较低，表明该相互作用主要为瞬时性质，不支持与HCO₃^?的稳定竞争。

**结论与讨论**

研究人员总结指出，本研究凸显了urate的多重抗氧化潜力，包括直接清除CO₃^•?以及与CO₃^•?生成酶（SOD1）和DNA修复酶（OGG1）的相互作用。通过分析log kTST与VDE和AEA的关系，确定了urate(H₂O)₆^?和CO₃(H₂O)₉^•?簇为生理pH 7.4下的存在物种，证实urate是有效的CO₃^•?体内清除剂，效力强于α-生育酚、α-CEHC、没食子酸盐和Trolox。分子对接显示urate与SOD1催化通道中ARG 141区域存在有利相互作用，但MD模拟表明这些相互作用主要为瞬时性质，无法确证与HCO₃^?的竞争，但提示urate可能对HCO₃^?相关的CO₃^•?形成具有调节作用。相反，urate对OGG1的结合较弱，不会损害其催化功能。MD模拟进一步证实urate结合不破坏SOD1或OGG1的结构稳定性。总体而言，这些发现为urate的双重抗氧化作用——高效自由基清除与酶介导氧化途径的调节——提供了机制性见解。