大麻萮酚(CBG)与大麻色烯(CBC)诱导肺癌细胞死亡及凋亡——PPARα对CBG效应的贡献

《Antioxidants》：Cannabigerol and Cannabichromene Induce Lung Cancer Cell Death and Apoptosis—Contribution of PPARα to Cannabigerol Effects

　　

摘要：大麻素(Cannabinoids)是潜在抗肿瘤制剂，可用于恶性肿瘤的附加治疗。本研究评估了既往较少被探索的非精神活性植物大麻素——大麻落酚(cannabigerol, CBG)和大麻色烯(cannabichromene, CBC)——对人非小细胞肺癌A549和H460细胞存活率、凋亡及线粒体功能的影响。CBG和CBC以浓度依赖性方式触发两种细胞系的细胞死亡、自噬及线粒体凋亡，凋亡证据包括Annexin V染色阳性、caspase-8、-9及-3/7活化、线粒体膜电位丢失及胞质线粒体细胞色素c(cytochrome c)水平升高。CBG还上调应激反应性转录因子ATF4(activating transcription factor 4, ATF4, 参与自噬与凋亡信号)并促进聚ADP-核糖聚合酶(poly(ADP-ribose) polymerase, PARP)裂解。两种大麻素均增加线粒体超氧阴离子(mitochondrial superoxide)生成并降低线粒体耗氧率(oxygen consumption rate, OCR)，CBG额外降低呼吸链复合物Ⅰ亚基NDUFB8(NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit B8)的表达。药理学受体调控实验表明，CBG和CBC诱导的细胞死亡不依赖于CB1、CB2、TRPV1(transient receptor potential vanilloid 1)、TRPM8及PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ)，而CBG介导的细胞死亡依赖PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor α)，该受体亦参与其促凋亡效应。综上，CBG和CBC在A549和H460细胞中诱导凋亡及细胞死亡，其中PPARα介导CBG的效应，提示其作为治疗靶点的潜力。

论文解读：《Cannabigerol and Cannabichromene Induce Lung Cancer Cell Death and Apoptosis—Contribution of PPARα to Cannabigerol Effects》，发表于《Antioxidants》

一、研究背景与目的

已有大量临床前证据表明多种大麻素对不同肿瘤实体具有抗癌作用，包括抑制肿瘤细胞增殖、血管生成、侵袭转移及诱导凋亡和自噬，且大麻素与常规化疗药物联用在肿瘤增殖与凋亡层面存在协同效应。首例随机Ib期临床试验显示，含大致等量Δ⁹-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol, THC)与大麻二酚(cannabidiol, CBD)的纳比西莫(nabiximols)添加至现有化疗方案中可延长复发性胶质母细胞瘤患者生存期。相比之下，非精神活性植物大麻素大麻落酚(cannabigerol, CBG)与大麻色烯(cannabichromene, CBC)的研究较为匮乏。CBG是THC生物合成前体，是植物大麻素中对TRPV1(transient receptor potential vanilloid 1)通道亲和力最强的配体，亦是TRPM8拮抗剂并可转录激活过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα)；CBC对CB₂受体具选择性及高效力并可激活TRPA1。2006年Ligresti等曾报道CBG与CBC的体外抗癌效应，但其诱导肿瘤细胞死亡的机制较CBD等其他植物大麻素少有探究，尤其CBG激活PPARα的特性此前未在癌症背景下被考虑——而PPARα在癌细胞中被证实可产生抗增殖、细胞毒、促凋亡及促进线粒体功能障碍的双重（促癌或抑癌）效应。因此，本研究旨在探讨CBG与CBC对人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞A549与H460存活、凋亡及线粒体功能与生物能学的影响，重点阐明PPARα在此过程中的作用，以验证非精神活性植物大麻素作为新型靶向治疗化合物的潜力。

二、主要关键技术方法

研究人员采用两株人NSCLC细胞系（A549购自DSMZ，NCI-H460购自ATCC），以血清游离DMEM进行药物处理。主要技术方法包括：结晶紫染色与MTT法检测细胞存活及代谢活性；克隆形成实验评估长期生存能力；Annexin V/7-AAD流式细胞术与细胞周期PI(propidium iodide)染色分析凋亡及细胞周期分布；Caspase-Glo发光法检测caspase-3/7、-8、-9活性；Western blot检测ATF4、PARP裂解片段(cleaved PARP, cPARP)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅰ/Ⅱ)、细胞色素c(cytosolic/mitochondrial cytochrome c, Cyt c)及氧化磷酸化(OxPhos)复合物亚基；MitoSOX Red荧光法检测线粒体超氧阴离子(mitochondrial superoxide)；JC-10探针检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, ΔΨm)；Seahorse XFe分析仪行线粒体压力测试测定耗氧率(oxygen consumption rate, OCR)；qRT-PCR检测PPARα mRNA；透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)观察线粒体形态；使用CB₁/CB₂/TRPV1/PPARα/PPARγ拮抗剂或激动剂进行药理学干预验证受体/转录因子依赖性。统计学采用Welch t检验或重复测量(repeated-measures, RM)单因素方差分析(one-way ANOVA)及相应事后检验。

三、研究结果

3.1 CBG和CBC以浓度和时间依赖性方式降低A549和H460细胞的存活率与代谢活性

通过结晶紫与MTT法检测发现，CBG与CBC在两种细胞系中呈时间及浓度依赖性抑制细胞存活与代谢活性。孵育24 h后，CBG的半数抑制浓度(IC₅₀)约为5～6 μM，低于CBC的约8～11 μM。克隆形成实验中，10 μM CBG使A549集落形成减少约33%，10 μM CBC使A549与H460分别减少约40%与34%，H460对CBG的集落抑制反应较弱。表明二者具浓度依赖性抗NSCLC细胞存活效应，CBG效力略强于CBC。

3.2 CBG和CBC降低A549和H460细胞存活率与代谢活性不依赖多种大麻素膜受体，但CBG效应经由转录因子PPARα介导

CB₁拮抗剂AM251、CB₂拮抗剂AM630、TRPV1拮抗剂capsazepine及TRPM8激动剂WS12/icilin均不能逆转CBG或CBC诱导的细胞存活下降。而PPARα拮抗剂GW6471与高选择性PPARα拮抗剂NXT629可浓度依赖性逆转CBG（而非CBC）引起的细胞存活与代谢活性下降及caspase-3/7活化，PPARγ拮抗剂GW9662无此作用。CBG浓度依赖性上调PPARα下游靶蛋白肉碱棕榈酰转移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A, CPT1A)，确认PPARα激活；CPT1A抑制剂etomoxir不影响CBG细胞毒性。qRT-PCR显示CBG不改变PPARα mRNA水平。结论：CBG（非CBC）的细胞毒与促凋亡效应由PPARα介导，不依赖经典大麻素膜受体及PPARγ。

3.3 CBG和CBC诱导A549和H460细胞凋亡与自噬

Annexin V/7-AAD染色显示两种大麻素浓度依赖性增加早、晚期凋亡细胞比例。细胞周期分析示G0/G1期细胞比例上升，G2/M期下降。Caspase活性检测示CBG与CBC浓度及时间依赖性激活caspase-8、-9及执行型caspase-3/7。Western blot示CBG显著上调cPARP及应激转录因子ATF4(activating transcription factor 4)，CBC上述效应较弱或无显著性；二者均上调自噬标志LC3-Ⅱ(微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ)。结论：CBG与CBC通过内源（caspase-9）与外源（caspase-8）凋亡途径诱导线粒体凋亡并伴有自噬激活，CBG效应更显著。

3.4 CBG以PPARα依赖方式诱导A549和H460细胞凋亡

PPARα拮抗剂GW6471显著拮抗CBG诱导的Annexin V阳性凋亡细胞增加及caspase-3/7活化，对CBC仅轻微减弱晚期凋亡细胞增加。GW6471还部分逆转CBG引起的H460细胞LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化。结论：CBG诱导的凋亡（及部分自噬标志）依赖PPARα信号，CBC凋亡不主要依赖PPARα。

3.5 CBG和CBC升高A549和H460细胞线粒体超氧阴离子水平，降低线粒体膜电位并使胞质细胞色素c升高

MitoSOX Red检测示CBG与CBC浓度及时间依赖性增加线粒体超氧阴离子生成。JC-10检测示二者浓度依赖性降低线粒体膜电位（去极化），CBC在此指标上稍强。细胞分馏Western blot示二者使线粒体内细胞色素c释放入胞质增多。结论：CBG与CBC引起线粒体氧化应激、膜电位崩溃及细胞色素c释放，符合线粒体介导的内源性凋亡启动。

3.6 透射电子显微镜显示CBG和CBC致A549和H460细胞线粒体结构改变

电镜观察：对照组线粒体形态规则、嵴丰富且与粗面内质网(rER)紧密接触；CBG处理组线粒体嵴结构紊乱、浓缩，伴自噬体(autophagosome)形成及线粒体相关膜(mitochondria-associated membrane, MAM)增宽/移位；CBC处理组主要表现为线粒体嵴损伤与线粒体肿胀，亦有自噬体与MAM改变。结论：二者引致明显线粒体超微结构损伤，与功能学线粒体毒性相符。

3.7 CBG和CBC抑制A549和H460细胞线粒体呼吸

Seahorse线粒体压力测试示CBG与CBC浓度依赖性降低基础呼吸(basal respiration)、ATP偶联呼吸(ATP-linked respiration)、备用呼吸容量(spare respiratory capacity)及质子漏(proton leak)；CBG（6 μM）抑制强于等摩尔CBC，且在无毒浓度（3 μM CBG）即抑制基础OCR。PPARα拮抗剂GW6471单独抑制OCR参数，但与CBG联用可在A549细胞部分逆转CBG对四项OCR参数的抑制。结论：二者损害氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)，CBG对线粒体呼吸的抑制部分经PPARα介导。

3.8 CBG降低A549和H460细胞呼吸链复合物Ⅰ亚基NDUFB8的线粒体蛋白水平

OxPhos抗体鸡尾酒Western blot显示，10 μM CBG处理24 h使两细胞系线粒体组分中复合物Ⅰ亚基NDUFB8(NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit B8)降低逾50%；CBC未引起同等程度呼吸链蛋白下调（仅H460中UQCRC2轻微下降）。结论：CBG特异性下调复合物Ⅰ关键亚基，为其抑制线粒体呼吸与促凋亡的机制之一。

四、讨论总结与研究结论

本研究首次证明非精神活性植物大麻素CBG与CBC在人NSCLC细胞A549与H460中介导浓度依赖性细胞死亡，机制涉及caspase-8/-9与caspase-3/7活化、Annexin V阳性凋亡、PARP裂解、ATF4上调、LC3-Ⅱ自噬标志升高、线粒体超氧阴离子累积、膜电位丧失、细胞色素c释放、电镜下线粒体超微结构损伤及OCR与复合物Ⅰ亚基NDUFB8下调。重要的是，研究人员发现CBG（非CBC）的细胞毒与促凋亡效应由转录因子PPARα介导——PPARα拮抗剂GW6471与高选择性NXT629可逆转CBG诱导的存活率下降、caspase-3/7活化及部分LC3-Ⅱ转换，且CBG浓度依赖性上调PPARα靶蛋白CPT1A确认其激活PPARα，该过程不依赖CB₁/CB₂/TRPV1/TRPM8及PPARγ。CBC的细胞死亡途径在本研究条件下未鉴定到明确起始受体，且不主要依赖PPARα。研究局限性包括未对CBC确定上游受体、PPARα激活仅通过CPT1A上调及药理学拮抗间接验证（未见基因敲低/报告基因实验直接验证）、未用siRNA进一步确证PPARα依赖性。

研究结论（译自原文Conclusions）：

本研究表明，相对少被探索的非精神活性植物大麻素CBG与CBC可在人肺癌细胞系A549与H460中诱导显著的促凋亡效应及线粒体功能障碍，其中CBG通过转录因子PPARα促进凋亡性细胞死亡。值得注意的是，在细胞活力降低及线粒体呼吸抑制方面CBG作用强于CBC，提示其在治疗开发上具更大转化相关性。PPARα参与CBG介导的细胞毒性值得在前期临床模型及其他肿瘤实体中进一步研究。