《Cells》：Generation of Chimera-Competent Avian iPSCs Using Defined Transcription Factors
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iPSC（induced pluripotent stem cell，诱导多能干细胞）技术在哺乳动物中已较为成熟，但在非哺乳类动物中仍发展不足。鸡iPSC（ciPSC）制备的主要障碍是缺乏物种特异性重编程因子及能支持禽类多能干细胞自我更新的培养条件。本研究报道
iPSC（induced pluripotent stem cell，诱导多能干细胞）技术在哺乳动物中已较为成熟，但在非哺乳类动物中仍发展不足。鸡iPSC（ciPSC）制备的主要障碍是缺乏物种特异性重编程因子及能支持禽类多能干细胞自我更新的培养条件。本研究报道利用七种鸡源转录因子组合（T7：Oct4、Sox2、Sox3、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28B）结合优化的禽类培养体系成功建立鸡iPSCs（ciPSCs）。转录组与功能分析表明，在禽类重编程中Sox3而非Sox2是主要的SoxB1因子。所得ciPSCs可稳定自我更新超过40代，表达核心多能性标志物，可分化为三个胚层，转录水平近似于鸡胚胎干细胞（ESC）。在嵌合体实验中，ciPSCs可贡献于体细胞、胚外及生殖系谱系，产生性腺内PGC样细胞但未获得完全生殖系传递能力。研究人员进一步证明T7系统可从鹌鹑、鸭、孔雀、斑胸草雀和鸽中诱导iPSCs，且鸭iPSCs可形成种间嵌合体，供体细胞见于宿主性腺。上述发现建立了可推广的禽类iPSC制备平台，可用于发育生物学研究及濒危鸟类生殖系保藏。
论文解读：《Generation of Chimera-Competent Avian iPSCs Using Defined Transcription Factors》发表于《Cells》
一、研究背景与立项依据
在哺乳动物中，诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）技术已十分成熟，被广泛用于发育生物学、疾病建模及濒危物种生殖系（germline）保存。然而在非哺乳动物尤其是鸟类中，iPSC研究严重滞后。既往利用哺乳动物OSKM（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）因子或鸡同源OSKM加Nanog、Lin28尝试诱导鸡iPSC（chicken iPSC, ciPSC），均未获得可长期稳定培养且具备高整合度嵌合能力及生殖系传递功能的细胞系，主因是缺乏适宜禽类多能干细胞自我更新的培养体系及正确的物种匹配重编程因子。此外鸡胚胎干细胞（chicken ESC, cESC）在长期培养后也容易丧失形成嵌合体和生殖系传递能力。研究人员前期开发了含卵转铁蛋白（ovo-transferrin, OT）、鸡白血病抑制因子（chicken LIF, chLIF）及三种小分子抑制剂IWR-1、G?6983、SB431542（合称OT/3i/chLIF）的体系可维持具生殖系能力的cESCs，并将传统N2B27基础培养基简化为只含胰岛素、转铁errin、BSA和亚硒酸钠四种成分的"E4"无血清基础培养基。本研究假设结合优化禽类培养条件与正确物种匹配转录因子组合可克服上述障碍，生成具功能多能性的禽类iPSCs。
二、主要关键技术方法
研究人员以E10.5鸡胚胎成纤维细胞（chicken embryonic fibroblast, CEF）为主力重编程起始材料，并以鹌鹑、鸭、孔雀、斑胸草雀及鸽子胚胎成纤维细胞验证跨物种适用性。采用基于小鼠莫洛尼白血病病毒（MLV）的pMX逆转录病毒系统分别表达7种鸡源转录因子（Oct4、Sox2、Sox3、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28B，即T7组合）。将原始OT/3i/chLIF体系中对CEF有毒性的SB431542替换为PDGFR抑制剂CP-673451，并以E4（DMEM/F12与Neurobasal 1:1混合，补加人胰岛素、亚硒酸钠、卵转铁蛋白及含脂质Albumax）为基础配制AC培养基（E4+IWR-1+G?6983+CP-673451+chLIF）。主要实验技术包括：逆转录病毒转导与鸡iPSCs诱导及长期传代培养、体外拟胚体（embryoid body, EB）三胚层分化与免疫荧光及qRT-PCR鉴定、高通量RNA-seq比对ciPSCs/cESCs/CEFs转录谱、外卵（ex ovo）及代壳卵（in ovo surrogate eggshell）嵌合体注射与活体GFP示踪、嵌合胚胎E7性腺分离DAZL与GFP双标PGC样细胞及PGC向胚胎生殖（embryonic germ, EG）细胞诱导转化、ciPSCs染色体核型分析、跨物种（鸭→鸡）种间嵌合体制备。
三、研究结果
3.1. OSKM Alone Is Not Sufficient for ciPSC Reprogramming
分别以鼠源及鸡源OSKM因子转导CEFs，未获得可扩增iPSC样克隆，仅出现神经元样细胞；而同样条件可成功重编程小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEF）为小鼠iPSCs，证明仅OSKM不足以重编程禽类体细胞，提示禽类多能网络不同。RNA-seq比较cESCs与CEFs显示Sox2在禽多能细胞中不富集，而SoxB1家族成员Sox3在cESCs及早胚（EGK.X期）高表达，提示Sox3为禽多能关键因子，另Nanog与Lin28B也显著富集。
3.2. Identification of Additional Reprogramming Factors for ciPSCs
基于转录组差异表达筛选确定候选重编程因子为Oct4、Sox3、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28B，并鉴于以往文献加入Sox2构成T7组合（Oct4、Sox2、Sox3、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28B）。
3.3. Generation and Characterization of T7-Derived ciPSCs
CEFs经T7逆转录病毒共转导后第5—6天出现iPSC样克隆，可挑取传代。单因子缺失实验显示去除任一因子均降低克隆数，缺Oct4、Klf4、c-Myc或Sox3无法长期扩增，缺Sox3则克隆分化为神经元样细胞印证其维持多能性作用，缺Sox2或Lin28B虽降效率但仍可扩增多代。完整T7组合效率最高。所得ciPSCs可稳定传至40代以上（P40），呈典型ESC形态，内源多能基因（Oct4、Nanog、Sox3等）高表达；EB分化后外、中、内胚层标志（Tuj-1、MHC、Gata4）经免疫荧光与qRT-PCR确认；P30核型多为二倍体ZZ，少数为Z三体；RNA-seq主成分分析（principal component analysis, PCA）与热图显示ciPSCs转录谱紧密聚类于cESCs及Stage X胚胎，证实成功重编程至多能态。
3.4. ciPSCs Contribute to Somatic Lineages in Chimeric Embryos
GFP标记ciPSCs植入EGK.X期受体胚盘或注射入经照射的受体胚下腔，外卵及代壳卵培养显示供体细胞广泛整合入躯体及胚外组织，E4约25%存活胚胎呈高水平整合，GFP信号见于眼、心、肠等。虽整体孵化率低（受照射及开壳系统影响）且高整合个体常伴E19颅部畸胎瘤（可能与残留病毒转基因表达有关），仍有低/中整合嵌合雏鸡孵化，羽毛及多组织PCR检出供体EGFP序列，证明ciPSCs具体内真正多能嵌合能力。
3.5. ciPSC-Derived PGC-like Cells Exhibit Limited Germline Competence
E7嵌合胚胎性腺检出DAZL+/GFP+双阳细胞，分离扩出GFP+PGC样细胞并表达PGC标志（低于野生型PGC）。少量早代PGC样细胞可在OT/3i/chLIF中转为EG样细胞并再形成嵌合体，但多数在饲养层上向神经元分化且无法经血液循环定植受体性腺，表明ciPSC来源PGC样细胞未获完全生殖系潜能，限制当前系尚不能实现种系传递。
3.6. Extension of the T7 Reprogramming System to Other Avian Species
相同T7系统与AC培养基自鹌鹑、鸭、孔雀、斑胸草雀及鸽子胚胎成纤维细胞诱导出iPSC样克隆并可传代；鸭iPSCs验证有多能标志表达与三胚层分化能力；GFP标记鸭iPSCs注入鸡胚形成鸭–鸡种间嵌合体，供体细胞达宿主性腺并见GFP+PGC样细胞（未能稳定扩增），证明T7策略具跨禽类普适性。
四、讨论与结论总结（翻译浓缩讨论部分核心结论）
既往鸡iPSC诱导失败源于次优转录因子组合及不支持禽多能干细胞自我更新的培养条件，本研究通过T7因子联合OT/3i/chLIF及禽源适配E4基础培养基同步突破两重障碍，其中E4去除促神经分化成分是关键。核心发现是Sox3而非Sox2为禽重编程中主导SoxB1因子——缺失Sox3致神经元默认分化，缺失Sox2仅降效率不影响扩增，提示Sox2在禽中可能倾向促进神经命运。相比哺乳动物仅需OSKM四因子，禽需七因子说明其多能网络更分散，Nanog与Lin28B对重编程时效与克隆稳健性贡献显著。所获ciPSCs具广泛躯体与胚外嵌合能力但未实现子代生殖系传递，PGC样细胞定位于性腺却缺迁移与完全生殖系功能，可能与逆转录病毒转基因持续表达干扰PGC特化及迁移、以及长期培养有关，高整合嵌合体E19颅部畸胎瘤亦佐证此点，未来需改用非整合递送系统（Sendai virus、episomal、mRNA等）。T7体系在五另种禽类成功诱导iPSCs并获鸭–鸡种间嵌合体示证跨物种保守性，但各物种PGC培养条件缺失为下一瓶颈。综上，本研究建立了具嵌合能力的稳定禽类iPSC平台，为禽类发育研究及濒危鸟类生殖系保藏提供通用策略，未来需结合无外源基因整合重编程与物种特异性PGC培养以实现完全生殖系传递。
