《Cells》：Regionalization of the Developing Hypothalamus: The Prosomeric and Tripartite Models
下丘脑（hypothalamus）是脊椎动物大脑中保守的结构，通过调节体温、睡眠、能量平衡和生殖等不同功能，在维持机体的稳态中发挥关键作用。下丘脑由并列的核团组成，呈现致密的组织结构。在发育过程中，可观察到前部、结节部和后部三个亚区。然而，由于其组织结构的复杂性，下丘脑的架构发育存在不同的发育模型。首先，prosome模型认为下丘脑是一个前部结构，分为两个不同的下丘脑prosome（Hp1和Hp2），并基于基因表达模式提出了其内部的进一步细分。其次，最近建立的三分模型基于基因表达模式、单细胞RNA测序（scRNAseq）、谱系示踪和功能实验，提出下丘脑在很大程度上是一个间脑结构，以区域/核团方式组织，并且乳头后区（retromammillary area, RMN）是间脑内位于zona limitans intrathalamica（ZLI）腹侧的下丘脑后部边界。除prosome和三分模型外，本综述还讨论了形成下丘脑区域的关键分子过程。最后，本研究主张将三分模型作为脊椎动物物种下丘脑形成的关键模型。
## 1. Introduction
本部分介绍了下丘脑作为脊椎动物大脑中最古老的结构之一，在维持能量平衡、调节体温和睡眠、控制生长、实现生殖和亲代行为以及建立昼夜节律中的重要作用。解剖学上，下丘脑沿前后轴（A-P）分为前下丘脑、结节下丘脑和乳头下丘脑，每个区域进一步组织成特定的核团，包含极为多样的神经元和胶质细胞类型。近30年的研究揭示了这些多肽在下丘脑内及下丘脑-外下丘脑神经回路中的多种功能。尽管下丘脑在脊椎动物生命中具有重要地位，但发育中下丘脑的区域化直到最近才变得清晰。本综述旨在讨论近期在理解发育中下丘脑区域化方面的进展，特别是考虑prosome和三分下丘脑亚区划分。
## 2. Developing Hypothalamic Progenitor Domains Define Adult Nuclei
在哺乳动物中，视前区（preoptic area）曾被争论为端脑而非间脑区域，因此常被单独分析。前下丘脑由前下丘脑核（AHN）、视上核（SON）、视交叉上核（SCN）和室旁核（PVN）组成；结节下丘脑包含外侧下丘脑区（LH）、弓状核（ARC）、背内侧下丘脑（DMH）、腹内侧下丘脑（VMH）及其迁移部分结节下丘脑核（TuN）；后部下丘脑或乳头下丘脑包括前乳头核（PMN）、乳头核（MMN）、乳头上核或乳头后核（RMN）和后下丘脑核（PHN）。正中隆起和垂体柄位于结节下丘脑腹侧。前丘脑（PTh）包括丘脑隆起（EmT）、未定带（ZI）和丘脑网状核（TRN）。
scRNAseq和基因调控网络（GRN）研究表明，这些成体解剖学亚区在胚胎期已被不同的祖细胞亚群所预测。这些研究揭示了祖细胞向分化神经元的 progression，并提供了比单纯基于神经肽/神经递质表达更准确的神经元定义方式。在神经发生高峰期（E11–E13），下丘脑的主要亚区沿A-P轴被识别：室旁核/视上核（PVN/SON）的有丝分裂后神经元前体细胞、下丘脑内斜线（ID）、结节乳头末端（TT）、腹内侧下丘脑（VMH）、弓状核（ARC）、前乳头核（PMN）、乳头核（MMN）和乳头后核（RMN）。ID平行于下丘脑A-P轴并向前延伸至视隐窝；TT是乳头和前乳头神经上皮之间的边界。
## 3. Induction and Regionalization of the Developing Hypothalamus
下丘脑（表达Foxd1）的前-背侧被端脑（表达Foxg1）、后-背侧被前丘脑（表达Pax6）以及后-腹侧被floorplate和间脑被盖（表达Arx、Fox1/2、Shh）所包围。下丘脑起源于下丘脑floorplate（HypFP）细胞，也称为嘴侧间脑腹侧中线细胞。在小鼠、鸡和斑马鱼神经板阶段，HypFP细胞表达Shh、Bmp7和Nkx2.1，位于表达Foxa2的间脑floorplate细胞的前方。HypFP细胞通过来自prechordal mesendoderm的Nodal、SHH和BMP信号的联合作用而被诱导。
来自prechordal mesoderm的Nodal触发下丘脑的诱导和模式形成。在斑马鱼Nodal相关配体突变体（cyc
-/-）或Nodal共受体突变体（oep
-/-）中，Nodal信号的消除导致下丘脑组织的完全丧失，与这些突变体的独眼畸形一致。Nodal信号是斑马鱼下丘脑Nkx2.1a和Nk2.1b旁系同源基因表达所必需的。
在培养的鸡HH4外植体中，大多数细胞表达Pax6但不表达Nkx2.1，而在HH6外植体中，存在表达Nkx2.1的细胞，其中一些共表达Pax6。HH8时，前丘脑和下丘脑的scRNAseq和RNA velocity显示从前丘脑样到HypFP集群的轨迹。从HH8到HH20/21，前丘脑样祖细胞（表达Pax6）逐渐减少，而下丘脑细胞（表达Shh/Nkx2.1）逐渐增多。这些结果共同表明前丘脑细胞被诱导为下丘脑命运，支持前丘脑和下丘脑命运紧密相连的观点，并表明最初共同域的形成。
scRNA-seq分析显示，表达Pax6的前丘脑样细胞在HH8–HH10表达FST（一种强效的Nodal拮抗剂）。在HH4鸡胚胎和 dissected prospective hypothalamus培养外植体中，抗FST处理增加了Nkx2.1/Shh表达的下丘脑域并减小了前丘脑Pax6域。相反，FST暴露几乎消除了Nkx2.1表达，并增加了胚胎或下丘脑外植体中Pax6阳性细胞的数量。因此，来自前丘脑的FST抑制下丘脑规格并限制发育中下丘脑的大小。
Nkx2.1
CreER/CreER突变体和杂合子同窝对照的杂交和RNAseq分析显示，Nkx2.1表达是形成包括ARC、VMH、PMN和MMN在内的中基底下丘脑所必需的，但不是RMN所必需的。E12.5时，突变体显示下丘脑基因的相对表达水平和表达细胞数量均减少，而前丘脑集群中的细胞数量增加，神经祖细胞的总体比例无显著变化。RNA velocity分析显示中基底下丘脑、乳头下丘脑和前丘脑之间的轨迹发生改变。因此，Nkx2.1不仅促进和维持腹侧下丘脑祖细胞的特性，还主动抑制前丘脑基因表达。这些结果指出前丘脑和下丘脑之间的细胞连续性，暗示它们来自共同区域（prosomere 3, p3），并且发育中的前丘脑（p3）和下丘脑之间存在边界的可能性极低。同时也为RMN与Nkx2.1依赖性中基底下丘脑相比具有不同发育途径提供了线索。
BMP信号在发育中的结节下丘脑中活跃。值得注意的是，磷酸化Smad1/5/8（BMP信号的关键效应子）在HH8后立即在前部HypFP细胞中被检测到，并传播到更后部的HypFP细胞。随着结节细胞的产生，BMP信号激活区和下层组织变得相对靠后，而前部结节域扩展。晚期指定的HypFP细胞显示更持续的磷酸化Smad1/5/8激活，并成为后部结节的胶质生成祖细胞。总之，下丘脑神经上皮内在因素足以维持结节下丘脑区域化和神经发生。
BMP在结节祖细胞中上调Tbx2，结果Shh表达以细胞自主方式下调。这可能通过Shh诱导的ventral tubero-mammillary前体中Smo表达的消除而发生。SHH信号的下调首先促进ventral tubero-mammillary祖细胞的进一步增殖，其次诱导Emx2表达。当BMP信号被Chordin消除时，下丘脑Tbx2表达丧失，但可通过Wif（Wnt抑制因子）激活而恢复。与此互补的是，Nodal信号的同时激活和Wnt-beta catenin信号的抑制是ventral midline floorplate样细胞中形成沿A-P轴区域化下丘脑所必需的。在斑马鱼中，Axin1（细胞内Wnt/beta-catenin抑制剂）的消除导致表达Emx2的后部身份下丘脑变小。有趣的是，Wnt8b表达侧翼RMN下丘脑，暗示它可能接受比结节和乳头下丘脑更持续的后部化信号，从而具有不同的命运。
来自ventral forebrain neuroepithelium的SHH对前部和结节下丘脑的分化至关重要。Shh最初在ventral下丘脑祖细胞中广泛表达，然后在结节下丘脑水平的ventral midline中迅速下调。当Shh从Nkx2.1-CRE × Shh
loxP/loxP小鼠的下丘脑基板和基底端脑中选择性去除时，Foxb1、Rx、Sim1和Irx5的表达维持，表明下丘脑乳头和视网膜后区域存在；但下丘脑细胞缺乏Pomc和Nkx6.2表达，表明antero-tuberal下丘脑神经核缺失；Nr5a1表明VMH核的分化受损；Lhx1、Lhx9、Lhx6表明ID和tuberomamillary terminal未分化。Lef1表达降低，提示前乳头神经上皮减少。由于端脑Foxg1表达未扩展，这些结果共同表明ventral diencephalic细胞仍816;然保留下丘脑身份但未能进行分化。此外，这些数据强调下丘脑和端脑组织之间不存在细胞命运转换，暗示两个区域之间可能存在边界机制，这是反对prosome模型的论点。
在E9.5小鼠下丘脑中，Shh在ventral midline相邻的双侧条纹中表达。紧邻Shh双侧条纹背侧的递祖细胞通过Gli1表达对SHH信号响应。Shh表达祖细胞贡献于部分ARC神经元和VMH的ventrolateral、ventral和central神经元。Gli1表达祖细胞的后代贡献于DMH和背外侧VMH。通过在Gli1表达细胞中删除Smo来条件性丧失结节下丘脑中的SHH信号，导致不同DMH和VMH神经元的增殖祖细胞自主减少。此外，Shh
Δhyp下丘脑显示SHH信号在背-腹（D-V）身份建立后仍然活跃。特别是，非分裂的ventral midline细胞群后来侧向扩展，Ascl1表达和随之而来的神经发生下调，而通常限制于dorsal diencephalic区域（前丘脑）的Pax6表达腹侧扩展。结果，Shh
Δhyp胚胎中结节下丘脑神经核缺失。这也是关于dorsal diencephalic（前丘脑）和下丘脑细胞之间紧密关系（命运转换）的线索，因为它们都来自共同区域。
前部下丘脑祖细胞表达Rax/Rx/Rx3。当Rx在E8.5之前在Rxf/f;CreER表达小鼠胚胎中失活时，前部和结节下丘脑缺乏Shh，背内侧下丘脑缺乏Otp、Pomc、Th1和Sst表达。互补地，Fgf10、Otx2和Tbx3的腹内侧表达向背内侧扩展。E9.5的Rx-CreERT2:MADM
GT/TG他莫昔芬诱导小鼠在E11.5/E12.5显示大多数Rx祖细胞是多能干性的，产生包括谷氨酸能VMH神经元和GABA能TuN神经元在内的多种神经元亚群。斑马鱼下丘脑细胞分化阶段SHH信号的时间控制抑制显示，Shh首先诱导然后下调Rx3表达。增殖祖细胞中SHH诱导的Rx3表达是前部/结节下丘脑延伸所必需的。随后的Rx下调是下丘脑各向异性生长、前脑室隐窝中Shh表达（Rx3不表达）细胞命运的规格、以及向Pomc（ARC）、Nr5a1a（VMN）和Th1、Otpb结节/前部细胞命运的分化所必需的。
scRNAseq数据上的RNA velocity推断，下丘脑分化轨迹由Six6/Fgf10表达祖细胞、Six6/Ascl1/Isl1表达神经发生前体、以及Six6/Nr5aA1/Pomc表达神经元组成。鸡HH8-9时，Six6和Tbx2在前部HypFP细胞中同时表达，随后不久在anterior tuberal Six6/Isl1表达细胞、Six6/Shh/Ascl1表达神经发生祖细胞、后部结节Tbx2表达祖细胞和Foxa2/Shh表达HypFP细胞中分离。鸡E5的杂交显示前部、结节和乳头域分别定义为Six3、Six3和Fgf10、以及Emx2表达祖细胞。然而，在9-10体节鸡中，仅存在结节Six3和Fgf10表达祖细胞。前部祖细胞在11体节出现，乳头祖细胞更晚至HH16才出现。尽管发育中鸡整个下丘脑区域扩展了约8倍，Fgf10表达祖细胞域保持恒定大小。Fgf10表达祖细胞被保留在中心并以细胞自主方式贡献于结节域。此外，EdU和DiI/DiO注射显示前部和乳头祖细胞来自高增殖的Fgf10表达祖细胞，并在从上文Fgf10表达域位移到前部和乳头域后开始分化。总之，下丘脑区域的发育是异时的并以各向异性生长为特征。
SHH信号参与这一依赖Fgf10表达祖细胞的下丘脑区域各向异性生长过程。9体节时，Shh和Fgf10在forebrain中短暂共表达。从11体节起，Shh在Fgf10表达祖细胞中下调并在包括出现的前部细胞在内的外周细胞中强表达。出现的前部祖细胞下调Fgf10并上调Shh和p57
Kip2，然后在分化时下调Shh。在控制时间段内受损的SHH信号导致前部祖细胞域的特异性丧失。因此，SHH信号的上调和随后的下调导致来自Fgf10表达细胞池的祖细胞增殖以及这些祖细胞的前部（而非结节）身份。
## 4. Transcription Factors Couple Regionalization and Differentiation of Hypothalamic Nuclei
参与早期下丘脑区域化的转录因子（TFs）也调控细胞分化。为识别控制下丘脑区域化和神经发生的GRN，Kim等研究者将SCENIC+分析应用于E11–E14 scRNA-seq和scATAC-seq数据集，推断key actors推断转录因子（TF）活性的模式。下丘脑TFs如Hmga1、Lin28a、Cited1和Gbx2在早期神经元前体细胞中活跃，而Tcf4、Npas3、Nfia/b/x、Zbtb20和Tox3在神经发生后期活跃。Hmx2/3和Isl1在结节、前乳头和前丘脑区域激活GABA能基因表达。此外，在Neurog2表达神经元中，前丘脑/ID TFs（Dlx1/2/5/6、Arx、Sp8、Meis2）激活GABA能基因如Slc32a1，而谷氨酸能TFs（如Barhl2）抑制这些基因。相反，谷氨酸能基因如Slc17a6由Neurog2特异性TFs（Barhl1、Nhlh2、Nr4a2、Lmx1a、Neurod1）和结节祖细胞特异性因子（Nkx2-1、Sox14）激活，并被前丘脑特异性TFs抑制。
不同TFs的功能丧失实验也有报道。前下丘脑沿mantle zone的内-外侧轴分为两个域。中位域表达Sim1和Brn2（E12.5），产生PVN和SON，而外侧表达Rgs4，产生异质的层状组织神经元。小鼠中Sim1活性的消除显示，Sim1是祖细胞增殖和Brn2表达激活所必需的。
Otp和Dlx2在TuN神经元中表达，并将TuN与Nkx2.1表达的VMH神经元区分开来。在VMH的祖细胞域中，稀有细胞以与Nr5a1互斥的方式表达Otp，迁移并积累在推定的TuN。使用Nkx2.1-Cre:H2B-GFP小鼠的谱系示踪分析显示，TuN中几乎所有Otp表达和几乎所有Dlx2表达神经元都是GABA能的，并源自Nkx2.1谱系。因此，令人惊讶的是，VMH的祖细胞域是共同祖细胞池，以镶嵌方式而非空间分离域的方式产生谷氨酸能VMH和GABA能TuN。
在Dlx5/6-Cre;H2B-GFP小鼠胚胎中的BrdU注射显示，VMH-TuN神经元具有顺序性和"由外向内"（outside-in）的出生顺序，早期出生的神经元主要位于外侧亚区，晚期出生的神经元位于内侧亚区。VMHvl和TuN神经元同时产生，VMH-TuN整体具有类层状结构。与TuN相反，在LH区域，发现单独表达Otp或Dlx的神经元，它们分别是谷氨酸能和GABA能的。
Arx在两个线性域中表达：一个平行于Shh表达的基底域向视隐窝延伸（平行并部分属于ID），另一个为TT。这导致两个Arx和Nkx2.1表达重叠但Shh不重叠的域。LIM同源域家族成员Lhx1、Lhx8和Lhx6的表达描绘了ID/TT的A-P轴。LHX TFs定义了一系列位于PVN和VMH之间及外侧的核团。前部ID中，E12.5时Lhx1在推定SCN中表达；E16.5时，Lhx1另外在SCN紧后方向背侧的区域表达。Lhx1表达域的后部与ID中Lhx8表达的前部重叠。Lhx8在Lhx1基础上进一步向后延伸并达到Lhx6表达的极限。ID的Lhx8表达域对应于DMN的中心区域。Lhx6在Arx和Nkx2.1表达的后部域之前的ID中表达。Lhx9在Lhx8的后-腹侧和ID中Lhx6阳性区紧腹侧的下丘脑Nkx2.1阴性区域表达。与Lhx6类似，Lef1在ventral posterior ID和TT域中表达。Lhx6
CreER/+;Ai9小鼠显示不同的Lhx6细胞共表达不同的转录因子：ID中的Nkx2.1、TT中的Dlx1/2、以及后部和ventral TT与dorsal TT铰链处的Nkx2.2。Nkx2.1、Nkx2.2和Dlx1/2的消除选择性地消除ID、铰链和TT域中的下丘脑Lhx6表达。
推定的ARC、正中隆起、垂体柄和垂体后ese来自表达Tbx3的基底下丘脑中线上， waive midline domain。Tbx3对pro-opiomelanocortin（POMC）或神经肽Y（NPY）和agouti-related peptide（AgRP）表达神经元的分化是必需的。ARC神经元通过组合Tbx3、Otp和DlxGFP表达分为不同的POMC和NPY/AgRP及TH神经元。成年小鼠ARC神经元的scRNAseq数据支持ARC分化为不同的细胞亚群。Otp和DlxGFP在ARC分化神经元中以互斥的salt-and-pepper模式表达。Otp活性的消除导致NPY、AgRP和Sst表达神经元的缺失以及Gad1、GR和Bsx表达的降低。相反，POMC和GHRH在Otp
-/-小鼠中表达，TH和Dlx1表达神经元的数量与野生型相似。因此，在发育中的ARC中，Otp不抑制Dlx1/2的表达。然而，DLX1/2直接结合并抑制Otp表达，这由ChIPseq分析、荧光素酶或由Dlx1/2调控元件控制的报告基因表达所显示。
在后部下丘脑中，Lef1和Irx5在位于MMN神经上皮紧前和紧后的PMN和RMN神经上皮中表达。通过Scenic+进行神经发生祖细胞分析推断，Neurog2表达细胞激活早期RMN特异性因子如Lmx1a、Foxa1/2和Irx3/5，而早期Ascl1表达细胞激活前丘脑特异性TFs，包括Dlx1/2/6、Sp8/9和Arx。这些结果表明RMN和前丘脑细胞的分化相互独立。
Cck在MMN和RMN神经元中表达，并由来自MMN和RMN的TFs如Nkx2.4和Uncx激活。然而，E13.5时MMN和RMN特异性TFs的非重叠表达模式可见，MMN和RMN基因相互拮抗它们的表达。例如，MMN（Lm1/5、Uncx和Nhlh2）激活但对RMN特异性TFs直接抑制。在RMN中，Tac1在特定神经元亚群中表达但在MMN中缺失。GRN分析推断Tac1由RMN特异性TFs（Lmx1a/b、Foxa2、Barhl1/2和Ebf2）直接激活，并被MMN特异性因子Nkx2.4抑制。这些结果揭示了MMN和RMN的早期发育途径是共同的，但控制分化步骤的TFs对每个核团是特异的。
## 5. The Prosomeric Hypothalamic Model
根据prosome模型，下丘脑是前脑的一部分，位于端脑腹侧、间脑前部。沿A-P轴，下丘脑分为两部分：后部的大脑脚hypothalamus（PHy），属于下丘脑prosome 1（Hp1）；和前部的终末hypothalamus（THy），属于下丘脑prosome 2（Hp2）。终末下丘脑包含单一的中央末端域（ATD）。沿alar/basal轴，Hp1和Hp2分别分为alar peduncular和terminal paraventricular及subparaventricular区、basal retrotuberal和tuberal以及basal retromammillary和mammillary区。每个alar和basal区域根据在区域中的位置进一步分为不同区域，如dorsal、central/intermediate、ventral或lateral。
prosome域与常规核团的拓扑对应关系如下：在alar plate中，peduncular paraventricular area（PPa）包括PVN，terminal paraventricular area（TPa）包括periventricular hypothalamic nucleus（PeVN），peduncular subparaventricular area（PSPa）包含entopeduncular nucleus（EnN），terminal subparaventricular area（TSPa）包含AHN、部分SON和lateroanterior nucleus（LAN）。在basal plate中，peduncular retrotuberal area（RTu）包括部分DMH、posterobasal nucleus（PBN）和部分LH；terminal tuberal area（Tu）包括DMH的另一部分、VMH和部分LH；ATD包含alar lamina terminalis、SON、anterobasal nucleus（ABN）、SCN和chiasmatic区域，以及ARC、正中隆起和infundibular/neurohypophysial区域；periretromammillary（PRM）和perimammillary esp（PM）包括背侧和腹侧PMN；retromammillary area（RM）包括RMN；mammillary area（MM）包括MMN。
这些下丘脑亚区最初由模式基因的表达所定义。下丘脑的basal部分通过ventricular zone中的Shh表达和mantle layer中的Nkx2.1与其alar部分区分。Otp和Sim1在alar peduncular dorsal、central和ventral paraventricular区域以及alar terminal dorsal、central和ventral paraventricular区域表达。Arx在alar PSPa和alar TSpa中表达。Nkx2.1在basal VMH和M中以及acroterminal ARC和neurohypophysis中表达。
prosome模型的作者指出，差异基因表达满足了对前部prosome Hp1和Hp2进行表征的假设。然而，详细检查时，几种基因表达模式对上述下丘脑划分的存在提出质疑。例如，在TpA中，Fgf15和Zic1/5在终末hypothalamus中的表达更偏内侧（即在ventricular zone中），而Otp、Sim1、Mfap4、Lmo4和Rgs4的表达更偏外侧。
## 6. The Tripartite Hypothalamic Model
最完整的前神经管命运图谱由Manning等（2025）提供。鸡胚胎在HH10时在前脑推定区域注射DiI/DiO，48小时后（HH17-20）进行分析。A-P轴被认为平行于下丘脑Nkx2.2表达域，D-V轴与之正交。DiI/DiO注射标签描述了生长线，显示特定区域如何通过差异定向生长产生鸡的前脑。关键生长模式通过遗传克隆分析和Rfp电穿孔胚胎得到确认。
命运图谱分析显示，HH20时，下丘脑由背侧的PVN下丘脑和腹侧的基底hypothalamic area组成。下丘脑在背侧和后侧与prethalamus分离，腹侧和后侧与相邻的间脑被盖以及Irx3和Arx表达floorplate的开始部分相邻。只有前部结节下丘脑起源于端脑腹侧。后ventral hypothalamus arises posterior to the telencephalon and ventral to areas that will give rise to PVN hypothamalus, prethalamus and thalamus。这就是下丘脑组织的三分hypothalamus模型。
HCR揭示了RMN发育身份。RMN由Lnfg不表达、Pitx2、Lmx1b和Shh表达的域组成，前部部分与Barhl2表达重叠，位于ZLI腹侧、前丘脑后下方。三分hypothalamic模型进一步得到命运转换实验的支持。当鸡下丘脑在神经管阶段被SHH抑制剂dorsalized时，保留了Shh表达降低和Nkx2.1表达减少的小基底区域。命运映射确认细胞迁移未改变。Pax2表达保留。Foxg1异位表达，但仅在前部最结节hypothalamus部分，暗示该下丘脑区的形成与端脑相关。结节hypothalamus的更后方，Pax6异位表达，Arx显著扩展，显示结节hyp丘脑区域转换为prethalamus/PVN。
此外，当PVN、端脑和前丘脑细胞在体外分离时，PVN hypo-thalamic细胞与前丘脑细胞混合，但与端脑细胞分离，暗示PVN hypothalamus与prethalamus组合为间脑的一部分、位于端脑后部。来自RM hippo-thalamus前部和后部的基底plate细胞在培养中分离，而来自下部hypothalamus内后部、前部或ventral位置的细胞混合。这些结果表明谱系限制可能在ZLI腹侧的RMN处运作。
基因表达、命运图谱、命运转换和细胞混合共同支持三分模型。根据该模型：（1）hypothalamus位于telencephalon、prethalamus和ZLI两个间脑部分的腹侧；（2）相对于prosome模型旋转了90度的D-V和A-P轴，使结节hypothamus成为腹侧结构；（3）前脑是非分节的，即不存在Hp1-Hp2边界；以及（4）rroe mammillary hypothalamus相对于下丘脑其余部分具有更后部的身份。
## 7. Genetic Mutations and Regulatory Networks Support the Tripartite Model
额外的功能研究为hypothalamus的区域化提供了证据。Six3和Irx3表达域的并列对应于zona limitans intrathalamica（ZLI），即prethalamus和thalamus之间的边界细胞群。Six3活性移除导致ZLI前alar plate中 severe forebrain truncations。然而，后部下丘脑区域仍然存在。Nkx2.1在basal plate的后hype、posterior to it small area中表达，Shh与Nkx2.1表达的残余域重叠。该域表达Irx3；因此，在Nkx2.1表达极限处的腹侧Shh表达域依赖于后部化的Irx3活性。该域内，ZLI ventral是Pitx2表达的对应于RMN的域。这些结果表明RMN是ventral forebrain的ventral A-P边界。
prosome和三分模型在Nkx2.2表达沿的alar basal hypothalamic boundary存在上一致。Nkx2.2是Shh响应性TF，在dorsal tuberal、ventral prethalamus和ID中表达。Nkx2.2缺失小鼠的GRN分析预测Nkx2.2直接激活tuberal hy、ID和thalamus特异性TFs并抑制RMN特异性TFs。与此一致，E12.5纯合Nkx2.2突变体的scRNA-seq显示ID和rethalamus减少、RMN细胞增加。
as discussed earlier, Nkx2.1表达对话是促进和维持中基底density下丘脑特性并抑制areeptalamic fate所必需的。Isl1在从prethalamus通过ID延伸到tuberal和PMN区域的域中的神经发生祖细胞和有丝分裂后前体中表达。RNAseq分析预测Isl1激活prethalamus、ID、tuberal和PMN中的TFs并抑制RMN、MMN和EmT中的TFs。互补地，在Isl1-null小鼠中，prethalamus和PMN细胞群减少，出现表达EmT样基因（Tbr1、Slc17a6）和RMN/MMN基因的突变特异性集群。Dlx1/2激活Ascl1和多个指定prethalamus、ID和PMN的基因，同时抑制Neurog2和驱动RMN、MMN及部分tuberal细胞类型的基因。
Lhx2表达通过持续抑制对应于EmT和前-背侧hypothalamus的替代命运来维持optic identity。总之，一系列TFs塑造了位于telencephalon、optic stalk、prethalamus和ZLI腹侧的下丘脑。Lhx2活性是aneuro-dorsal hippo-thamalus所必需的。破坏Isl1、Nkx2.2或Dlx1/2活性导致prethalamic identity丧失和RMN特异性基因的ectopic induction，这是这两个区域紧密相连形成且它们之间不存在边界的强有力证据。
## 8. Hypothalamic Regionalization in Zebrafish
prosome模型已应用于斑马鱼hypothalamus，但缺乏命运图谱。在小鼠中，基因表达模式在相对较晚的hypothalamic发育中进行分析。换句话说，prosome边界M、RM、PM和PRM与 distinct gene expression limits不巧合。然而，三分hypothalamic development modeliany rea中表达的所有基因在斑马鱼中都存在，包括Pitx2、Emx2、Arx、Wnt8b、Lmx1b、Berhl2和Irx3，它们的表达谱可以在正确的发育时期通过hypothalamic floorplate ese进行分析。
## 9. Conclusions
Manning等通过详细的命运图谱、基因表达模式、scRNAseq分析和功能实验表明，hypothalamus的主要部分发育于ventral to PVN hypothalamus、prethalamus and ZLI。由Lnfg不表达和Pitx2、Irx3、arhl1表达的细胞表征的retromammiy hypothalamus area具有posterior identity，可能位于thalamus/pretalus边界的hypothalamus和diencephalic tegmentum之间的ventral forebrain的ventral A-P边界。遗传和GRN分析支持三分模型。ZLI和RM间脑连续性可能在所有脊椎动物物种中保守。
