体外培养猪卵巢颗粒细胞过程中调控细胞对外源及内源刺激响应的基因转录组图谱

《International Journal of Molecular Sciences》：Transcriptomic Profile of Genes Regulating Cellular Response to Extra- and Intracellular Stimuli in Porcine Ovarian Granulosa Cells During In Vitro Cultivation

　　

颗粒细胞（Granulosa Cells, GCs）作为卵巢卵泡的组成部分，对卵母细胞成熟、卵泡发生（Folliculogenesis）及类固醇生成（Steroidogenesis）至关重要。颗粒细胞通过为卵母细胞提供代谢和激素支持、维持其质量并调节其减数分裂停滞，在受精过程中发挥关键作用。卵母细胞质量和受精效率依赖于颗粒细胞的正常活性，尤其是其相互通讯、代谢支持及抗氧化保护功能。一旦这些功能受损，颗粒细胞可能参与多囊卵巢综合征、卵巢早衰（Premature Ovarian Failure）、原发性卵巢功能不全（Primary Ovarian Insufficiency）及卵巢储备功能减退的病理发生。颗粒细胞位于卵泡腔（Antrum）中，与周围细胞通讯，形成动态微环境，并调节激素生物合成。为分析调控内源性信号传导的分子机制，研究人员考察了猪颗粒细胞在体外培养48、96和144小时期间的动态转录组响应。转录组分析揭示了与细胞对内源性和外源性刺激响应、化学化合物代谢、血管发育及颗粒细胞迁移相关基因的可变且动态性转录上调。基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析同样突出了"细胞对化学刺激的响应"和"细胞对有机物质的响应"等条目。特定基因如HSD3B1、POSTN、LOX、SERPINB2、ITGB3、ANKRD1、SLC1A1和SFRP2表现出显著的表达变化，提示颗粒细胞存在广泛的自我调控和代谢改变。进一步分析表明，细胞对细胞因子刺激的响应、生长因子响应、激素响应、酶联受体蛋白信号传导以及细胞迁移的正向调控均有所改善。这些发现揭示了体外培养期间颗粒细胞间通讯的调控机制相互交织，尽管缺乏来自天然卵巢环境的信号。对检测通路间相互作用的进一步研究将为颗粒细胞在卵泡发生、卵母细胞成熟和排卵中作用的潜在临床应用提供更全面的理解和见解。

该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》，旨在通过体外培养模型探究猪卵巢颗粒细胞在脱离天然微环境后的分子适应性机制，为理解卵泡发育及辅助生殖技术提供理论依据。

## 研究背景与问题

卵巢颗粒细胞是包围卵母细胞的体细胞，与卵丘细胞（Cumulus Cells, CCs）、卵泡膜细胞（Theca Cells）共同构成卵巢卵泡的复杂微环境。在卵泡发育晚期，颗粒细胞围绕充满卵泡液（Follicular Fluid, FF）的卵泡腔分布，通过缝隙连接与卵丘细胞直接通讯，形成高度动态的微环境，调控卵母细胞成熟、卵泡发生和类固醇生成。颗粒细胞在激素生物合成中居核心地位，尤其负责雌激素和孕激素的芳香化与分泌，这些激素影响卵泡局部动态及全身生殖功能。此外，细胞色素P450酶系（如CYP19A1芳香化酶）、17α-羟化酶及3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-Hydroxysteroid Dehydrogenase）等催化过程对类固醇生成至关重要；而基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases, MMPs）、纤溶酶原激活物等则参与卵泡细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的动态重塑，保障卵泡发育和排卵。

然而，颗粒细胞的功能依赖于与周围细胞及内源性因子的持续互作。当这种互作中断时，可能导致多囊卵巢综合征、卵巢早衰等病理状态。尽管体外培养系统为研究颗粒细胞行为提供了可控环境，但长期脱离天然卵巢微环境后，颗粒细胞如何维持存活、适应培养条件、调控基因表达网络，其分子机制尚不明晰。特别是，猪颗粒细胞因生理特性与人类模型高度相似，其体外培养模型对转化医学研究具有重要价值。因此，该研究旨在通过时间序列转录组分析，系统揭示猪颗粒细胞在体外培养过程中的分子调控机制，识别潜在的分子标志物，为卵巢疾病的靶向治疗及辅助生殖技术优化提供理论基础。

## 主要技术方法

研究人员采用以下关键技术开展研究：实验样本来源于40头170日龄、体重约98 kg的Landrace杂交母猪，采集80个卵巢、穿刺抽取直径大于5 mm的窦前卵泡获取卵泡液及颗粒细胞；细胞于含2%胎牛血清的DMEM培养基中，在38°C、5% CO₂条件下培养，分别于0 h（对照）、48 h、96 h和144 h收集样本；总RNA提取采用TRI试剂结合氯仿-异丙醇法；转录组分析使用Affymetrix PorGene 1.1 ST芯片进行全基因组表达谱检测，数据经RMA算法标准化，通过Bioconductor进行生物信息学分析，采用DAVID工具进行GO富集分析，利用"Limma"算法筛选差异表达基因（Differential Expressed Genes, DEGs），以|倍数变化（Fold Change）|>2且校正p<0.05为阈值；功能通路分析采用pathfindR鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络中的富集通路，并用Metascape进行功能富集聚类；基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）使用"clusterProfiler/Bioconductor"计算归一化富集评分（Normalized Enrichment Score, NES）；使用RT-qPCR对芯片数据进行定量验证，以ACTB、GAPDH和HPRT为内参基因，采用2^?ΔΔCT法计算相对表达量。

## 研究结果

**差异表达基因的鉴定与GO富集分析**：研究人员通过"Limma"算法鉴定了不同时间点与对照组相比的差异表达基因。GO生物学过程分析显示，在六个显著富集的过程中，有五个在所有时间点均显著上调，仅" negative regulation of catalytic activity"仅在96 h组增强。其中，"cellular response to chemical stimulus"和"cellular response to organic substance"涉及的富集基因数最多（150个基因）。

**基因表达模式的分层聚类分析**：通过层次聚类热图可视化了培养过程中基因表达的变化模式。48 h时，HSD3B1、POSTN、LOX、SERPINB2和ITGB3的倍数变化最高，分别为124.5、95.2、67.3、41.2和29.9；96 h时，ANKRD1、HSD3B1、ITGB3、SLC1A1和SFRP2显著上调，倍数变化分别为91.2、80.5、39.9、36.7和30.8；144 h时，POSTN、HSD3B1、LOX、ITGB3和SERPINB2表达变化最为显著，倍数变化分别为88.9、88.1、75.6、57.7和44.9。总体而言，LOX、ANXA8和GREM1在所有时间点表达均上调。

**火山图揭示的转录组动态**：48 h组共鉴定出610个下调和828个上调基因；96 h组有1014个基因抑制、1206个基因激活；144 h组为732个抑制和1025个上调基因。与内源性刺激和化合物代谢相关的最富集基因包括LOX、POSTN、HSD3B1、ANXA8、GREM1、CCBE1和SLC1A1等。研究发现，96 h是调控内源性刺激和化合物代谢的最活跃时间点。

**通路富集分析**：PathfindR分析揭示，在所有分析组中，"proteoglycan in cancers"通路主要富集。基因与条目关联分析显示，所有基因无论在哪一组或富集过程中均表现出表达增加。GSEA分析显示，仅五个（48 h）和六个（96 h和144 h）调控过程被抑制，而血管发育调控和细胞对外部刺激响应的调控均有所改善。被抑制的过程包括"cellular response to metal ion"、"cellular response to inorganic substance"、"response to insulin stimulus"和"negative regulation of the cell cycle"等。

**Metascape功能富集分析**：在排名前20的统计显著GO条目中，前五项分别为：细胞对细胞因子刺激的响应（GO:0071345, log₁₀(P)= ?60）、对生长因子的响应（GO:0070848, log₁₀(P)= ?43）、对激素的响应（GO:0009725, log₁₀(P)= ?42）、酶联受体蛋白信号通路（GO:0007167, log₁₀(P)= ?35）以及细胞迁移的正向调控（GO:0030335, log₁₀(P)= ?34）。这些结果通过聚类算法以网络布局呈现，便于识别可能共享共同潜在机制的相关生物学过程和通路。

**RT-qPCR验证**：研究人员使用RT-qPCR技术对芯片数据进行定量验证。结果显示，四个基因的表达变化方向得到验证；仅SERPINB2基因的表达变化方向与芯片结果不一致，这可能源于芯片与PCR引物设计所针对的转录本变体不同，而RT-qPCR因涵盖所有可用转录本变体且定量可靠性更高，其结果更为可信。

## 讨论与结论

研究人员在讨论中指出，体外培养过程中颗粒细胞表现出可变且动态的程序化转录特征。GO富集分析表明，"cellular response to chemical stimulus"和"cellular response to organic substance"的富集不仅反映代谢活性的增强，更体现了将细胞外刺激感知并转导为细胞内响应的互连信号通路的激活。

研究人员特别分析了关键基因的功能关联：POSTN（编码骨膜蛋白Periostin）、LOX和ITGB3形成功能相关的ECM-整合素信号模块，参与基质组织、机械转导（Mechanotransduction）和细胞存活。POSTN通过结合含ITGB3的整合素复合物，激活黏着斑激酶（Focal Adhesion Kinase, FAK）、PI3K/AKT和MAPK信号通路；LOX介导的胶原交联进一步稳定ECM并改变其生物力学特性，增强整合素依赖性信号。这种协调的ECM重塑可能代表颗粒细胞对体外贴壁依赖性生长的适应性响应，模拟排卵前卵泡黄体化相关的结构重组。HSD3B1的上调对孕酮合成至关重要，其表达受促黄体生成素（Luteinizing Hormone, LH）调控，在黄体化过程中高度表达。研究人员指出，HSD3B1与ECM相关基因的共上调可能表明机械转导与类固醇生成之间的功能偶联，即ECM的结构重塑可能主动支持长期培养期间类固醇活性表型的获得。

关于时间动态，研究人员观察到各时间点的特异性基因表达：96 h时ANKRD1、SLC1A1和SFRP2显著增加。ANKRD1通过调节内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）应激影响凋亡；SFRP2负向调节促性腺激素反应性，减弱FSH和LH介导的卵泡存活；SLC1A1则参与营养转运，支持卵泡细胞发育期间的代谢需求。这些基因共同展示了平衡增殖、代谢、细胞间调控和类固醇生成的复杂信号通路网络。

火山图揭示了培养过程中的转录变化模式：与0 h相比，48 h共有1438个基因改变，96 h达2120个，144 h回落至1757个，提示96 h是体外培养期间调控内源性刺激和化合物代谢的最强烈时间点。这与前人关于原代猪颗粒细胞凋亡相关基因（如BCL2和BAX）在培养第5天出现表达改变的发现相呼应。

PathfindR揭示的蛋白聚糖相关通路富集具有重要意义。蛋白聚糖在细胞-细胞及细胞-ECM相互作用中功能多样，对卵巢卵泡发育尤其重要，包括颗粒细胞在卵丘-卵母细胞复合体中的组织、支持卵母细胞生长和成熟等。研究人员强调，该富集反映的是体外培养期间的正常细胞过程，而非肿瘤表型。

GSEA分析显示，长期培养期间仅少数过程被抑制，包括与金属离子、无机物质、胰岛素刺激响应及细胞周期负调控相关的过程。研究人员认为，这可能反映体外环境相对孤立和化学稳定的特性：生理条件下颗粒细胞暴露于卵泡液、卵泡膜细胞和全身循环来源的动态离子、代谢物、激素和旁分泌因子波动中，而这些离子（尤其是钙、锌、铁、镁）是细胞内信号、线粒体活性、氧化平衡和类固醇生成的关键调节因子；培养条件下这些通路的减弱可能表明颗粒细胞对环境离子信号的响应性降低。胰岛素响应通路的抑制则可能源于培养系统的内分泌限制，提示细胞代谢逐渐适应培养基提供的营养条件，而非依赖生理性内分泌调节，转向维持存活和结构稳定性而非增殖活性。

研究人员总结指出，所鉴定基因不应被解读为孤立的生物标志物，而应视为整合ECM重塑、机械转导、类固醇生成、应激信号和代谢适应的互连调控通路的组成部分。观察到的时序动态提示，颗粒细胞最初激活ECM和黏附相关的适应性机制，随后是与应激响应稳定和代谢稳态相关的转录程序，这种顺序激活可能构成颗粒细胞在缺乏天然卵巢微环境时维持活力和功能可塑性的基本机制。

研究人员也承认体外模型的局限性：尽管 Allows精确控制实验条件，但无法完全复制体内高度复杂的卵巢微环境。生理条件下颗粒细胞持续受到内分泌信号、旁分泌通讯、ECM互作及与周围卵泡细胞信号的影响，这些均可能显著影响细胞行为和基因调控。尽管如此，颗粒细胞的转录波动确保长期培养仍能提供关于颗粒细胞调控的有价值见解。

**研究结论**：体外培养颗粒细胞揭示了以广泛上调参与细胞对内源性和外源性刺激响应、化学化合物代谢以及血管发育 processes related to 颗粒细胞 的基因为特征的动态转录变化。HSD3B1、LOX和POSTN的转录变化提示了细胞间通讯 underlying 的协调且互连的调控机制。所揭示的过程表明 granulosa cells 对培养环境变化的敏感性。随后，与应对内质网应激和凋亡相关的过程，以及支持增殖的过程，在调控颗粒细胞中似乎发挥重要作用。各时间点的。主要变化与细胞间通讯和 aimed at 适应环境条件的转变相关。对通路间相互作用的进一步研究将对理解颗粒细胞在生殖系统中的作用，尤其是卵泡发生、卵母细胞成熟和排卵，提供更全面的认识。