《International Journal of Molecular Sciences》：Differential Biotransformation of Glycyrrhizin by Licorice-Derived Endophytic Fungi and Accumulation-Promoting Effects of Fungal Inoculation
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药食同源(Medicine food homology, MFH)植物富含营养及活性次生代谢物，其内生真菌(endophytic fungi)介导宿主次生代谢物的关键生物转化(biotransformation)。甘草作为代表性MFH药材，以三萜皂苷甘草酸(g
药食同源(Medicine food homology, MFH)植物富含营养及活性次生代谢物，其内生真菌(endophytic fungi)介导宿主次生代谢物的关键生物转化(biotransformation)。甘草作为代表性MFH药材，以三萜皂苷甘草酸(glycyrrhizin, GL)为主要活性成分，其水解产物甘草次酸(glycyrrhetinic acid, GA)和3-O-单-β-D-葡萄糖醛酸基甘草次酸(glycyrrhetinic acid 3-O-mono-β-D-glucuronide, GAMG)比GL具有更强的生物活性和生物利用度，但甘草内生真菌介导GL生物转化的酶学机制尚不清楚。本研究从甘草中分离筛选得到9株具显著GL诱导型β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase, GUS; EC 3.2.1.31, 糖苷水解酶家族2, Glycoside Hydrolase Family 2, GH2)活性的内生真菌。通过原核及真核表达系统获得4种功能性GH2 β-葡萄糖醛酸苷酶，证实其可通过两条不同水解途径催化GL生物转化。将这4株菌株接种至甘草可显著提高宿主GL积累。本研究为高效制备高价值GL衍生物提供了新的酶学资源，并提出通过绿色策略提升甘草中GL含量，深化了对药用植物内生菌–宿主代谢互作(endophyte–host metabolic crosstalk)的认识。
本文对发表于《International Journal of Molecular Sciences》的研究论文《Differential Biotransformation of Glycyrrhizin by Licorice-Derived Endophytic Fungi and Accumulation-Promoting Effects of Fungal Inoculation》进行解读总结。
研究背景与立项依据
药食同源(Medicine food homology, MFH)植物如甘草(Glycyrrhiza spp.)富含黄酮类和三萜皂苷类次生代谢物，其中甘草酸(glycyrrhizin, GL)是甘草根特有的三萜皂苷(triterpene saponin)，具抗炎、抗病毒等药理活性。GL在C?3位连有两个β?D?葡萄糖醛酸残基，其人体肠道菌水解产物——甘草次酸(glycyrrhetinic acid, GA)及3?O?单?β?D?葡萄糖醛酸基甘草次酸(glycyrrhetinic acid 3?O?mono?β?D?glucuronide, GAMG)——生物活性与生物利用度均优于GL。内生真菌(endophytic fungi)是植物全生物体(holobiont)组成部分，可分泌多样水解酶如β?葡萄糖醛酸苷酶(β?glucuronidase, GUS; 属糖苷水解酶家族2, Glycoside Hydrolase Family 2, GH2)，代谢宿主植物专一性代谢物(plant secondary metabolites, PSMs)以维持共生，但甘草内生真菌中催化GL生物转化的GH2酶及其分子机制尚不明确。本研究旨在鉴定甘草内生真菌来源的GL诱导型GH2 β?葡萄糖醛酸苷酶，阐明其催化GL的酶学特征与途径差异，并考察功能菌株回接对宿主甘草GL积累的调控效应。
主要关键技术方法
研究人员从健康甘草根中分离并保存33株内生真菌；以含GL为唯一碳源的最小培养基(Minimal Medium, MM_GL)初筛GL利用菌株，结合高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)检测发酵液中GL转化率；采用X?Gluc染色法检测GL诱导的β?葡萄糖醛酸苷酶(GUS)活性。对具GL代谢及GUS活性的9株菌进行ITS序列系统发育鉴定及全基因组测序，基于CAZy数据库注释筛选GH2家族候选基因，通过同源建模、分子对接(molecular docking)预测GL结合能力。候选GH2基因克隆至pET?32a(+)载体于大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达并纯化，体外测定GL催化活性及产物，经HPLC?串联质谱(HPLC?MS/MS)定性确证产物为GL(m/z 821.4 [M?H]?)、GAMG(m/z 645.4 [M?H]?)和GA(m/z 469.3 [M?H]?)；优化IPTG浓度、诱导温度及反应缓冲体系pH、温度、时间。将GH2基因克隆至植物表达载体pMDC83，农杆菌(Agrobacterium rhizogenes GV3101)介导在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片中瞬时表达，外源施加GL验证体内催化活性，qRT?PCR检测基因相对表达量及GL诱导表达模式。将4株功能内生真菌孢子悬液接种表面消毒甘草种子，栽培后于2、5、12月龄取根，HPLC外标法测定GL及甘草苷(liquiritin)含量，Pearson相关分析GH2基因转录水平与GL积累关系。
研究结果
2.1. Glycyrrhizin?Metabolizing Activity and β?Glucuronidase Expression in Licorice Endophytic Fungi（甘草内生真菌的甘草酸代谢活性与β?葡萄糖醛酸苷酶表达）
33株内生真菌中18株可在MM_GL平板上生长，其中16株具GL代谢能力(转化率29.46%~100%)。X?Gluc染色显示：Penicillium expansum H3组成型表达GUS；Fusarium spp.(Z9, Z11, Z22, Z25, H16, H24)及Clonostachys rhizophaga(Z32, Z35)呈GL浓度依赖性诱导表达GUS。形态学与ITS系统发育将H3定为扩展青霉(Penicillium expansum)，Z32/Z35定为根生粘帚霉(Clonostachys rhizophaga)，Z9/Z11/Z22/H16定为Vanetten镰刀菌(Fusarium vanettenii)，Z25定为Falciform镰刀菌(Fusarium falciforme)，H24基因组注释为粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)。结论：甘草内生真菌可通过GL诱导表达GH2家族β?葡萄糖醛酸苷酶启动GL生物转化。
2.2. Candidate β?Glucuronidases Exhibit Potential Glycyrrhizin?Binding Activity（候选β?葡萄糖醛酸苷酶具潜在甘草酸结合活性）
9株菌基因组共注释出93个GH2家族基因，系统发育分析选取与已知GL水解GUS聚类的10个候选基因；MEME模体分析显示多数含9?10个GH2保守催化模体。AlphaFold/SWISS?MODEL同源建模显示预测结构可信(EMQE 0.81?0.96)；AutoDock分子对接显示GL可与所有候选蛋白活性中心葡萄糖醛酸残基形成氢键(结合自由能?3.45~?7.05 kcal/mol)。结论：筛选出的12个候选GH2蛋白具备催化GL的结构与结合潜力。
2.3. β?Glucuronidase from Licorice Endophytic Fungi with Glycyrrhizin Catalytic Activity（具甘草酸催化活性的甘草内生真菌β?葡萄糖醛酸苷酶）
原核表达验证：H3GH2(Penicillium expansum)、Z32GH2(Clonostachys rhizophaga，序列同Z35GH2?1)、H24GH2(Clonostachys rosea)、Z35GH2(Clonostachys rhizophaga, Z35A01005)具GL水解活性。其中H3GH2、Z32GH2、H24GH2催化GL经两步水解依次脱去两个葡萄糖醛酸生成GAMG再生成GA；Z35GH2仅催化GL脱去一个葡萄糖醛酸生成GAMG（单步水解）。HPLC?MS/MS确证产物。结论：四种GH2酶分属两类催化途径——双步(GL→GAMG→GA)与单步(GL→GAMG)。
2.4. Optimization of β?Glucuronidase Induction and Catalytic Conditions（β?葡萄糖醛酸苷酶诱导及催化条件优化）
最适诱导：H3GH2/Z32GH2 0.1 mM IPTG、16 ℃；H24GH2 0.5 mM IPTG、16 ℃；Z35GH2 0.1或1.0 mM IPTG、16 ℃。最适催化：H3GH2—HAc?NaAc pH 5.0, 50 ℃, 30 min, GL转化率100%；H24GH2—TBS pH 7.4, 37 ℃, 10 h, GL转化率100%；Z32GH2—PB pH 6.0或TBS pH 7.4, 37 ℃, 1 h, GL转化率100%，GA得率最高达86.96%；Z35GH2—HAc?NaAc pH 5.0, 37 ℃, >5 d, GAMG得率最高43.01%。结论：四种GH2酶催化最适条件各异，在pH 5?7.4、15?50 ℃具稳定催化活性。
2.5. Validation of the In Vivo Catalytic Activity of the Target β?Glucuronidase（靶标β?葡萄糖醛酸苷酶体内催化活性验证）
pMDC83?GH2经农杆菌浸润本氏烟草叶片，qRT?PCR证实异源表达。外源GL处理后，转化叶中GL显著降低：H3GH2组GL转化率73.58%(GAMG)+8.75%(GA)，具双步活性；Z32GH2、Z35GH2、H24GH2组仅检出GAMG，转化率分别为18.55%、32.24%、38.64%。结论：四种GH2酶在植物体内保留GL转化活性且催化类型与原核体外一致。
2.6. Expression Patterns of β?Glucuronidase Genes Induced by Glycyrrhizin（甘草酸诱导的β?葡萄糖醛酸苷酶基因表达模式）
qRT?PCR显示：H3GH2在1 g/L GL时相对表达最高；Z32GH2随GL浓度升高表达上调；Z35GH2?1在3 g/L GL时最高；H24GH2呈先降后升模式。同一基因(Z32GH2/Z35GH2?1)在不同菌株(Z32 vs Z35)中对GL浓度响应模式不同。结论：四个GH2基因受GL浓度依赖性诱导，表达模式具菌株特异性。
2.7. Analysis of Structure?Activity Differences in GH2 Proteins（GH2蛋白结构与活性差异分析）
H3GH2、Z32GH2、H24GH2三维结构高度相似(RMSD 0.126?0.261 ?)，含相同保守域(Glyco_hydro_2_N、Immunoglobulins、Gly_hydro_2_C)及GO注释(葡萄糖醛酸苷分解代谢、β?葡萄糖醛酸苷酶活性)；Z35GH2与之结构差异大(RMSD ~26?30 ?)，含甘露糖苷酶Ig/CBM样域及β?半乳糖苷酶/葡萄糖醛酸苷酶域，GO注释为糖蛋白分解代谢、β?甘露糖苷酶活性。结论：催化类型相同的GH2酶结构域与模体保守；结构域差异决定Z35GH2仅具单步水解活性。
2.8. The Effect of Inoculation with Endophytic Fungi on the Accumulation of Active Components in Licorice（内生真菌接种对甘草活性成分积累的影响）
接种H3、Z32、Z35、H24后，各生长期甘草根GL含量均显著升高(为对照1.09?2.48倍)：2月龄H3促GL积累最强(+85.37%)；5、12月龄Z32促GL积累最强(+112.42%、+148.91%)，H24促GL增加最低(+11.61%)。甘草苷含量仅2月龄接种组显著升高。GH2基因(H3GH2、Z32GH2、Z35GH2)转录水平与接种后GL含量显著正相关(p<0.05)，H24GH2无显著相关性(r=0.122, p=0.754)。结论：具GL水解活性的内生真菌回接可促进宿主甘草GL积累，促进效应与菌株种类、宿主生育期及GH2基因表达水平相关。
讨论与结论总结
讨论指出，本研究首次从甘草内生真菌中鉴定出分别催化GL双步与单步水解的GH2家族β?葡萄糖醛酸苷酶，其中H3GH2、Z32GH2、H24GH2具典型GH2四聚体结构，Z35GH2为GH2家族中具单步GL→GAMG活性的新成员。酶在宽泛pH与温度下稳定，适于GL衍生化物工业化生物转化。本氏烟草瞬时表达系统可用于真菌糖苷水解酶体内功能评价。内生真菌GH2基因的GL诱导表达及菌株回接促GL积累现象提示内生菌?宿主间存在代谢对话(metabolic crosstalk)，GH2酶活性与促GL积累效应呈正相关，为通过有益内生菌定向调控药用植物品质形成提供理论依据。
结论(Concluding Remarks)：研究人员从甘草中筛选出9株具GL代谢及GL诱导型GUS活性的内生真菌，鉴定并验证了4种GH2 β?葡萄糖醛酸苷酶(H3GH2、H24GH2、Z32GH2、Z35GH2)可通过双步(GL→GAMG→GA)或单步(GL→GAMG)途径催化GL水解；GH2基因为GL浓度依赖性诱导表达；4株功能菌株回接甘草可显著提升根部GL积累。本研究阐明了内生真菌GH2酶催化GL生物转化的分子机制，为高价值GL衍生物生物制备及利用内生真菌提升甘草品质提供了新酶学资源与绿色策略，拓展了对药用植物内生菌?宿主专一性代谢互作的理解。
