陆稻地方品种17SM-19幼苗叶片花青素生物合成的转录组分析及关键基因鉴定

《Agronomy》：Transcriptome Analysis and Identification of Key Genes Involved in Anthocyanin Biosynthesis in Leaves of Upland Rice Seedlings of Landrace 17SM-19

　　

花青素（Anthocyanins）是重要的类黄酮（flavonoid）化合物，在水稻中具有显著的抗氧化活性和观赏价值。本研究以陆稻（upland rice）地方品种（landrace）17SM-19为材料，测定了一叶期（S1）和二叶期（S2）叶片中的花青素含量。S1时期的花青素含量（43.37 U/g）显著高于S2时期（16.54 U/g）。以S1为对照，在S2中总共鉴定出9865个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），其中4702个上调表达，5163个下调表达。功能富集分析显示，这些DEGs显著富集于光合作用和核糖体等条目和通路中。通过对这些DEGs的筛选，鉴定出10个结构基因和4个与花青素生物合成相关的调控基因。定量实时PCR（Quantitative real-time PCR, qPCR）验证了转录组数据的可靠性。这些结果为揭示水稻叶片花青素生物合成的分子机制提供了有价值的线索。

**论文解读：陆稻地方品种17SM-19幼苗叶片花青素生物合成的转录组分析与关键基因鉴定**

**一、研究背景与意义**

水稻（*Oryza sativa* L.）是世界三大粮食作物之一，全球约半数人口以其为主食。随着生活水平和健康意识的提升，水稻的功能性成分与附加价值日益受到关注。叶片紫色是花青素（Anthocyanins）积累的重要表型，花青素作为类黄酮（Flavonoid）代谢途径的关键终产物，不仅赋予植物独特的观赏价值，还具有显著的抗氧化活性，能够增强水稻对紫外线、低温、干旱等非生物胁迫的耐受性。紫色叶色表型还可作为育种中的有效形态标记，用于提高选择效率。然而，当前对水稻叶片花青素合成调控机制的理解仍不完善，尤其是紫色表型随生长发育动态变化的现象及其分子基础尚不清晰。陆稻地方品种17SM-19在田间表现出不稳定紫色叶片，推测受环境因子调控，因此研究人员以其为材料开展研究，旨在揭示花青素合成的分子调控网络并筛选关键候选基因，为分子育种提供理论依据。该论文发表在《Agronomy》期刊上。

**二、主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：以陆稻地方品种17SM-19（保存于上海农业生物基因中心，编号AA070052）为材料，在人工气候室水培条件下，于13天（一叶期，S1）和21天（二叶期，S2）采集叶片样本。通过植物花青素测定试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）测定花青素含量；利用TRIzol法提取总RNA，构建cDNA文库并在Illumina NovaSeq 6000平台进行mRNA测序（mRNA-seq）；使用DESeq2（v1.26.0）进行差异表达基因（DEGs）鉴定（阈值：调整p值（Q值）< 0.05且|log₂FC| > 1）；通过Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析探究DEGs功能；利用MEGA 12进行系统发育分析；采用定量实时PCR（qPCR）验证转录组数据及其筛选的结构基因与调控基因。

**三、主要研究结果**

**3.1 不同苗期对17SM-19叶片颜色和花青素含量的影响**
通过肉眼观察和花青素含量测定，发现S1（一叶期）叶片紫色显著深于S2（二叶期），且S1花青素含量（43.37 U/g）显著高于S2（16.54 U/g）（p < 0.05），证实叶片紫色深浅与花青素积累呈正相关。

**3.2 不同苗期间的差异表达基因**
以S1为对照，对叶片进行mRNA-seq分析，获得高质量数据（Q30 > 93%）。共鉴定出9865个DEGs，其中4702个基因上调表达，5163个基因下调表达。这些DEGs被认为可能包含调控花青素合成的关键基因。

**3.3 DEGs功能分析**
对上调DEGs进行GO富集分析，显著富集于9个条目，前三为类囊体（thylakoid）、光合作用（photosynthesis）及前体代谢物和能量的产生；下调DEGs显著富集于38个条目，前三为含蛋白质复合物、核糖核蛋白复合物和核糖体。KEGG富集分析显示，上调DEGs显著富集于光合作用-天线蛋白、碳代谢和光合作用等通路；下调DEGs显著富集于核糖体、DNA复制和范可尼贫血通路。这些结果表明S2时期光合作用增强而蛋白质合成相关过程减弱。

**3.4 直接参与花青素生物合成的DEGs鉴定**
从DEGs中筛选出10个与花青素生物合成相关的结构基因：4个属于苯丙氨酸代谢途径的*OsPAL*基因（编码苯丙氨酸解氨酶Phenylalanine Ammonia-Lyase）在S2上调；6个属于类黄酮生物合成途径的基因——*OsCHS24*（查尔酮合酶）、*OsF3H-1*、*OsF3H-2*（黄烷酮-3-羟化酶）、*OsF3′H*（类黄酮-3′-羟化酶）、*OsDFR*（二氢黄酮醇-4-还原酶）和*OsANS*（花青素合酶）在S2均下调，与花青素含量降低一致。对于调控基因，从DEGs中识别出130个转录因子（25个MYB、55个bHLH、50个WD40），结合系统发育分析和已知功能，进一步筛选出1个MYB（Os05g0553400）和3个bHLH（Os01g0865600、Os11g0158500、Os12g0160400）可能参与花青素调控，其中3个bHLH均下调。

**3.5 mRNA-seq数据验证**
随机选取8个DEGs进行qPCR分析，结果显示所有基因的上/下调趋势与RNA-seq数据一致，且相关系数（R²）达0.9065，证实转录组数据的可靠性。

**3.6 候选结构基因与调控基因的定量PCR验证**
对10个结构基因和4个调控基因进行qPCR验证。除3个基因因表达丰度过低无法检测外，其余基因表达趋势与RNA-seq高度一致，其中5个基因在S1与S2间差异显著，进一步证明转录组分析筛选候选基因的高效性和可靠性。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，PAL家族基因在S2上调，与花青素含量下降趋势不一致。研究人员分析认为，PAL处于苯丙烷代谢途径早期，其产物不仅用于花青素合成，也可分流至木质素、水杨酸等其他途径，因此PAL表达与花青素积累的关系并非绝对直接。此外，下调的*OsCHS24*、*OsF3H-1/2*、*OsF3′H*、*OsDFR*和*OsANS*与花青素降低一致，表明这些结构基因在S1时期的高表达是紫色形成的关键。在调控层面，筛选出的1个MYB和3个bHLH可能通过形成MYB-bHLH-WD40（MBW）复合体参与调控，其中WD40在DEGs中未发现显著差异，推测其仅起支架作用且表达水平相对稳定。

**结论（翻译原文结论）**：本研究以陆稻地方品种17SM-19为试验材料，分析了一叶期（S1）和二叶期（S2）叶片的紫色表型、花青素含量及转录组图谱的差异。结果表明，S1叶片紫色显著深于S2，S1花青素含量（43.37 U/g）显著高于S2（16.54 U/g），证实叶片紫色强度与花青素积累呈正相关。以S1为对照的转录组测序鉴定出9865个差异表达基因（DEGs），包括4702个显著上调和5163个显著下调基因；共47个Gene Ontology（GO）条目显著富集，36个Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集，提示这些生物学过程可能参与叶片花青素的合成与调控。进一步鉴定出10个花青素生物合成相关的结构基因和4个调控基因。综上，本研究不仅阐明了陆稻幼苗叶片花青素积累的表型和生理特征，还鉴定出一组关键基因，为深入解析陆稻叶片花青素合成的分子机制提供了核心遗传资源和理论支持，同时为通过分子育种策略定向改良水稻花青素含量及相关农艺性状奠定了重要基础。