回混加速截短侧耳素降解并改善截短侧耳素菌渣的堆肥性能而不加剧抗生素耐药性风险

《Sustainability》：Back-Mixing Accelerates Pleuromutilin Degradation and Improves the Composting Performance of Pleuromutilin Mycelial Residue Without Aggravating Antibiotic Resistance Risk

　　

回混在实际堆肥中被广泛应用以启动过程和改善堆肥产品质量。然而，对于抗生素菌渣（AMR），一种含有残留抗生素的发酵副产物，这种处理方式的生态安全性尚不明确。在本研究中，研究人员对截短侧耳素菌渣（PMR）进行了为期35天的好氧堆肥实验，设置了回混处理组（T组）和常规堆肥组（CK组），以评估堆肥性能和抗生素耐药性风险。结果表明，T组表现出更快的升温速度和更高的腐殖化程度。此外，T组不仅截短侧耳素降解更快，比CK组提前3天达到检测限以下，而且抗生素耐药基因（ARGs）最大降低3.1倍，可移动遗传元件（MGEs）总体降低93.2%。冗余分析（RDA）、方差分解分析（VPA）和共现网络分析表明，在测试条件下，微生物群落结构与ARGs变异的关联似乎强于MGEs。总体而言，回混加速了截短侧耳素降解并增强了PMR堆肥性能，同时在测试的堆肥条件下未观察到检测ARGs的显著富集。该研究为AMR的安全资源化利用提供了科学依据。

### 论文解读：回混加速截短侧耳素降解并改善堆肥性能而不加剧抗生素耐药性风险

#### 研究背景与意义
全球抗生素消费量预计到2030年将比2020年增加超过50%，抗生素生产的扩张不可避免地产生大量抗生素菌渣（AMR），其中截短侧耳素菌渣（PMR）是兽用抗生素泰妙菌素制造过程中的典型副产品。由于下游提取不完全，PMR中残留大量截短侧耳素，可能促进残留抗生素和抗生素耐药基因（ARGs）的传播，因此被列为中国国家危险废物名录中的危险废物。好氧堆肥被广泛认为是处理和资源化利用AMR的有效策略。回混（将部分稳定的堆肥引入新鲜原料）在大规模堆肥中常用于缩短启动阶段、增强微生物活性和提高效率。然而，对于含有残留抗生素的AMR，回混是否会影响抗生素去除和抗生素耐药风险尚未系统研究。潜在担忧是，来自含抗生素基质的成熟堆肥可能仍携带ARGs和可移动遗传元件（MGEs），重新引入新系统后可能成为耐药性储库，通过水平基因转移促进ARGs扩散。此外，回混可能通过重塑初始微生物群落结构和改变理化条件，影响抗生素降解途径和耐药组的进化动态。因此，本研究聚焦于PMR的好氧堆肥处理，评估回混对堆肥性能和抗生素耐药风险的双重影响，为AMR的安全资源化利用提供科学依据。该论文发表在《Sustainability》。

#### 主要关键技术方法
研究人员从宁夏泰瑞制药有限公司获取PMR，采用碱性热处理（0.2 mol/L NaOH，80°C，90分钟）预处理，然后与麦秸、麦麸按干重4:1:1混合调节C/N比，添加0.6%有效微生物（EM）菌剂，调节含水率至60%。堆肥反应器（约50 L）配备恒温加热套以最小化热损失，曝气速率0.25 L/(min·OM)（定时开关30分钟循环）。设置回混组（T组，添加4%成熟堆肥）和常规对照组（CK组），堆肥35天，在1、3、5、7、10、14、21、28、35天从顶部、中部、底部三层采样混合。主要方法包括：液相色谱法测定截短侧耳素浓度；理化性质分析（温度、pH、电导率EC、有机质OM、C/N比、总氮TN、铵态氮NH₄⁺-N、硝态氮NO₃^--N）；三维激发-发射矩阵荧光光谱（3D-EEM）结合平行因子分析（PARAFAC）表征溶解有机物；实时定量PCR（SYBR Green法）检测8个目标基因（ARGs：vgaA、salA、lsaC、tva(A)、cfrA、Tae(A)；MGEs：intI1、Tn916/1545）；16S rRNA基因V3-V4区高通量测序分析细菌群落；统计方法包括Spearman相关、主坐标分析（PCoA）、冗余分析（RDA）、方差分解分析（VPA）和共现网络分析。

#### 研究结果
##### 3.1 对堆肥系统的影响
**3.1.1 理化性质**：通过温度监测和理化指标分析发现，T组升温更快，第2天达62.1°C，同期CK组仅59.0°C；T组高温期（>55°C）持续时间更长。T组pH值在整个堆肥过程中始终高于CK组，EC在加热期上升更快。T组有机质（OM）降解效率比CK组高7.4%，C/N比下降幅度较小但TN含量始终较高。T组NH₄⁺-N波动较平稳，高温期积累较少，而在成熟和固化期NO₃^--N浓度高于CK组。NH₄⁺/NO₃^-比在两组中均快速下降，但T组始终较低，表明更稳定的氮转化过程。
**3.1.2 堆肥腐熟度变化**：通过3D-EEM-PARAFAC分析，识别出四个荧光组分（C1-C4），其中C1、C2、C3为类腐殖质物质，C4为蛋白质/色氨酸类物质。T组在大部分堆肥期间类腐殖质组分（C1-C3）比例平均比CK组高8.4%，C4降解更彻底（T组降低95.6%，CK组88.9%）。腐殖化指数（HIX）在T组始终略高，光谱比值（S_R）较低，表明回混促进了更高分子量和芳香性的腐殖质生成。

##### 3.2 对抗生素耐药风险的影响
**3.2.1 抗生素残留**：通过液相色谱法测定截短侧耳素浓度，两组均在第10天低于检测限（50.0 μg/kg）。T组在第7天即达到检测限以下，而CK组此时仍有0.65 mg/kg残留。降解动力学符合准一级模型，T组降解速率常数（k = 0.857 d^-1）显著高于CK组（k = 0.555 d^-1），表明回混加速了截短侧耳素的消散。
**3.2.2 抗生素耐药基因**：通过qPCR检测8个基因，lsaC和tva(A)在两组中均未检出。热图和log2倍变化分析显示，T组中salA、vgaA、Tae(A)相对丰度降低更显著，vgaA最大降低3.1倍。cfrA在两组中均有增加，但T组增幅较小。MGEs方面，T组intI1在加热和高温期较高，随后逐渐下降；Tn916/1545在T组整体低于CK组。到第35天，T组中intI1和Tn916/1545的联合相对丰度比CK组降低93.2%。

##### 3.3 细菌群落的演替
**3.3.1 细菌丰度与多样性**：通过Alpha多样性指数（Chao1、Shannon、Pielou均匀度）和PCoA分析发现，T组Shannon指数始终高于CK组，Chao1在加热和高温期较低，但后期略有下降。PCoA（Bray-Curtis距离）显示两组群落结构差异显著，T组在成熟期群落结构与CK组第1天相似，而CK组在高温至成熟期的群落与T组第35天相似。
**3.3.2 细菌组成**：门水平上，T组前21天门级分布更均匀，而CK组以Pseudomonadota、Bacillota和Actinomycetota为主。属水平上，CK组优势菌为Bacillus（属于Bacillota），T组优势菌为Acinetobacter和Pseudoxanthomonas（属于Pseudomonadota）。回混促进了需氧异养菌的增殖。

##### 3.4 环境因素、细菌群落和MGEs对ARGs的影响
通过RDA、VPA和共现网络分析探究ARGs变异的驱动因素。RDA前两轴解释71.1%调整后方差，其中C/N比、温度和截短侧耳素浓度与ARG变异最相关，pH关联较弱，MGEs贡献较小。VPA显示环境因素（17.7%）、截短侧耳素浓度（18.0%）和MGEs（10.0%）单独解释部分，环境因素与截短侧耳素的交互作用最大（44.3%）。共现网络分析表明，cfrA与Bacillota的4个属相关，Tae(A)、salA、vgaA与Pseudomonadota多个属相关，intI1与Pseudomonadota的6个属及其它门类相关，而Tn916/1545仅与两个属相关。这些结果暗示ARGs动态与微生物群落演替的关联强于MGEs介导的传播。

#### 讨论与结论
讨论部分总结了回混加速堆体升温的机制（引入适应性微生物并优化理化条件），pH和EC变化的微生物学解释，以及有机质降解、氮转化和腐殖化过程的增强。抗生素残留的快速降解归因于高温和功能微生物的引入。尽管检测到的ARGs和MGEs在T组最终降低，但cfrA的增加可能与Bacillota群落的持续存在相关，而非直接由回混引入。RDA和VPA一致表明，环境因素和残留抗生素对ARGs变异的解释度高于MGEs，水平基因转移可能不是主要机制。研究局限性包括缺乏独立的反应器重复和仅测试了一种回混比例，未来需在不同规模下验证。

**结论翻译**：该研究评估了回混对PMR堆肥过程中堆肥性能和抗生素耐药风险的双重影响。回混加速了温度升高，增强了生物降解和腐殖化，并促进了截短侧耳素的消散。在T组中，ARGs的最大降低达到3.1倍，MGEs总体降低93.2%。RDA、VPA和共现网络分析提供了一致证据，表明在测试条件下，ARGs动态与环境变化和微生物群落演替的关联似乎比MGEs介导的传播更密切。总体而言，在测试条件下，回混改善了堆肥的成熟度和稳定性，且未观察到检测ARGs或MGEs的显著富集。这些发现虽然需要进一步验证，但突出了回混作为值得进一步研究的PMR堆肥策略的潜力。