鸡肝中结肠弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌液滴数字PCR定量分析的样品处理优化

《Pathogens》：Optimization of Sample Processing for Droplet Digital PCR Quantification of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni in Chicken Liver

　　

在鸡肝中准确检测弯曲杆菌（Campylobacter）受到强烈基质抑制的阻碍。本研究评估了样品处理策略，以改善鸡肝中结肠弯曲杆菌（Campylobacter coli）和空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）的液滴数字PCR（ddPCR）定量。研究人员比较了机械均质化（Stomacher）和酶/机械解离（gentleMACS），有或没有8 μm过滤。颗粒大小分析表明，过滤，特别是在gentleMACS处理后，产生了更小、更均匀的颗粒并减少了变异性。降解百分比测定证实，与Stomacher均质化相比，gentleMACS实现了显著更大的组织破碎。同时靶向C. coli和C. jejuni的多重ddPCR检测产生的液滴计数与单靶标反应相当，表明在测试条件下靶标之间干扰最小。在接种的肝脏样品中，gentleMACS处理产生的液滴计数与从纯培养物中获得的相似，而未处理的肝脏引起严重的基质干扰和不一致的定量。此外，gentleMACS处理的样品在定量C. coli和C. jejuni时表现出强的log-log线性，能够检测到每个反应接近1个基因组拷贝当量。总体而言，结果表明，酶/机械解离结合细孔过滤改善了鸡肝中弯曲杆菌属（Campylobacter species）的ddPCR检测。

论文解读文章

研究背景与问题：弯曲杆菌属（Campylobacter spp.），尤其是空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）和结肠弯曲杆菌（Campylobacter coli），是全球最常见的食源性胃肠炎细菌病因之一，在美国每年约导致130万病例，感染可引发格林-巴利综合征等严重后遗症。家禽产品是主要传染源，鸡肝的污染率高达40%–78%，浓度可达1.8 log CFU/g（菌落形成单位/克），且常被用于轻煮菜肴，对消费者构成显著风险。美国农业部食品安全检验局（FSIS）使用MLG 41.09方法进行监测，但仅能检测存在与否，无法提供定量数据。定量数据对于评估污染趋势、干预效果及微生物风险评估至关重要。现有定量方法如最大可能数（MPN）法耗时且易受变异影响，定量PCR（qPCR）虽快但受基质抑制剂干扰。液滴数字PCR（ddPCR）可实现绝对定量且无需标准曲线，但鸡肝基质的高粘度、脂质和细胞碎片会破坏液滴生成，导致定量不准确。因此，需要有效的样品前处理策略以减轻基质抑制。

研究内容与结论：本研究系统比较了传统机械均质化（Stomacher）与酶/机械解离（gentleMACS）对鸡肝中C. coli和C. jejuni的ddPCR定量的优化效果。通过颗粒大小分析、降解率测定及ddPCR定量（纯培养和人工污染样品）评估，发现gentleMACS结合8 μm过滤能显著减小颗粒大小、提高均匀性，并增加组织降解程度。在人工污染鸡肝中，gentleMACS处理样品的液滴计数（平均12543个）远高于未处理样品（3593个），且log-log线性回归R²值达0.96（C. coli）和0.98（C. jejuni），检测限接近每个反应1个基因组拷贝当量。多重ddPCR靶向间无干扰，纯培养实验证实灵敏度高（~1细胞）且动态范围宽（10²–10⁵ CFU）。研究意义在于为复杂食品基质中弯曲杆菌的ddPCR定量提供了优化的样品处理方法，有望支持更准确的食品安全监测与风险评估。该论文发表在《Pathogens》。

关键技术方法：本研究采用的主要关键技术包括：1) 颗粒大小分析：使用动态光散射仪（Mastersizer 3000）测定体积粒径分布，样品经130 mL纳米纯水稀释后测量。2) 降解率测定：样品经8 μm滤纸真空过滤后烘干称重，计算质量损失百分比。3) 多重ddPCR：使用QX200自动液滴生成仪生成液滴，CFX96深孔热循环仪扩增（程序：95°C 10 min；40个循环95°C 30 s、58°C 1 min；98°C 10 min；4°C 10 min），QX600液滴读取仪分析，靶向C. jejuni的hipO基因和C. coli的cdtA基因。4) 样品处理：使用Stomacher 3500进行机械均质化（30 s，150 rpm），或使用gentleMACS Octo Dissociator进行酶/机械解离（程序37C_m_LIDK_1，搭配肝脏解离试剂盒）。样品来源：鸡肝购自当地零售店，经约25 kGy电子束辐照以消除内源性微生物，制备成肝脏冲洗液后人工接种C. coli YH509和C. jejuni YH009（分离自零售禽肉/肝脏产品）。

研究结果：
3.1 全肝与肝脏冲洗液的颗粒大小分布：通过动态光散射测量，未过滤的Stomacher和gentleMACS样品颗粒分布相似。过滤后，gentleMACS处理样品的分布显著向更小粒径偏移，表明酶/机械解离产生更细的碎片并通过8 μm滤膜。肝脏冲洗液分析显示过滤能有效去除大颗粒，减少重复间变异。研究说明过滤是提高均匀性的关键，而gentleMACS通过产生更细颗粒增强了过滤效果。
3.2 肝组织降解率：通过降解率测定，gentleMACS处理样品的降解百分比显著高于Stomacher处理组和未处理对照组（Student's t检验，p < 0.0002）。视觉检查干燥残留物也证实gentleMACS组残留物更少。研究说明酶/机械解离是破碎肝组织最有效的方法。
3.3 C. coli和C. jejuni纯培养的ddPCR定量：在无基质条件下，多重ddPCR在10倍系列稀释的纯培养中保持线性定量，R² > 0.97，检测限约1个细胞/反应。双靶标同时扩增未影响液滴生成或出现竞争。研究说明多重ddPCR在纯培养中灵敏且鲁棒。
3.4 人工污染鸡肝中C. coli和C. jejuni的多重ddPCR检测：在人工污染鸡肝中，gentleMACS处理样品平均产生12543个可接受液滴，未处理样品仅3593个（95% CI：3051–4135），纯培养对照为21466个。gentleMACS处理样品的log-log线性回归显示R² = 0.96（C. coli）和0.98（C. jejuni），检测限约1基因组拷贝/反应。未处理样品因低液滴数导致定量高估。研究说明gentleMACS解离能显著改善液滴生成和定量准确性，但对复杂基质仍需有效前处理。

讨论部分总结：研究指出鸡肝基质的高粘度、碎片和脂质会干扰液滴生成，导致可接受液滴数降低和定量偏倚。gentleMACS结合8 μm过滤能减轻基质抑制，但过滤可能导致靶细胞损失，需在解读时考虑。未处理样品的低液滴数导致正的阳性分割膨胀，是已知伪影。研究仅使用人工污染样品和单一分离株，且未纳入内部扩增控制（IAC）或实验室间比较，这些是未来验证的方向。

研究结论翻译：本研究表明，酶/机械gentleMACS解离结合细孔（8 μm）过滤可改善鸡肝基质中弯曲杆菌属（Campylobacter spp.）的ddPCR定量性能。该工作流程减少了基质干扰，稳定了液滴生成，支持在检测动态范围内的一致性定量，并在鸡肝中实现了低至每个反应约1个基因组拷贝当量的准确检测。这些发现表明，基于gentleMACS的处理可以提高复杂食品基质的分析性能。然而，需要跨其他食品基质、自然污染样品和实验室间进行额外验证，以完全确立其可扩展性和普适性。