靶向正埃博拉病毒（Orthoebolavirus）内体受体NPC1结合位点的肽类进入抑制剂研发

《Pathogens》：Development of Peptide Entry Inhibitors Targeting the Endosomal Receptor NPC1 Binding Site of Orthoebolavirus

　　

正埃博拉病毒可引起严重的埃博拉病毒病（Ebola virus disease, EVD）并在人类中引发致命性暴发。该病毒感染通过巨胞饮作用（macropinocytosis）并经早期内体、晚期内体及溶酶体转运，利用内体受体尼曼-匹克C1型蛋白（Niemann–Pick C1, NPC1）进入细胞质。研究人员基于NPC1受体设计了靶向NPC1结合位点以阻断病毒入侵的肽类抑制剂。结果表明，基于配体的肽类抑制剂在体外研究中对假型病毒或复制型正埃博拉病毒均显示出强效的抑制活性。因此，研究人员进一步在小鼠模型中评估了其中一种抑制剂对鼠适应型埃博拉病毒（mice-adapted Ebola viruses）攻击的保护效果，与对照组相比显示出一定的保护效力。该研究表明，基于配体的肽类是开发抗埃博拉病毒感染抑制剂的有前景的方向。

埃博拉病毒病（Ebola virus disease, EVD）是由正埃博拉病毒（Orthoebolavirus）引起的严重出血性疾病，病死率高达25%至90%，是威胁全球公共卫生安全的重大烈性传染病。尽管已有两种单克隆抗体药物（REGN-EB3和mAb114）于2020年获美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准，但这些抗体药物存在明显局限性：其一，具有株特异性，仅对埃博拉病毒扎伊尔种（Orthoebolavirus zairense, EBOV）有效，而对本迪布焦种（Orthoebolavirus bundibugyoense, BDBV）等其他种无效；其二，生产成本高昂且需要冷链储运，在非洲等医疗资源匮乏地区难以普及。因此，研发更高效、经济且使用便捷的抗埃博拉病毒药物具有迫切的现实需求。

正埃博拉病毒为单股负链RNA病毒，基因组约19 kb。该病毒通过巨胞饮作用进入细胞，经早期内体、晚期内体最终到达溶酶体，在此过程中利用内体中的NPC1受体完成病毒包膜与细胞膜的融合，从而将病毒遗传物质释放至细胞质。NPC1是一种大型跨膜蛋白，含有13个跨膜螺旋，由N端结构域（Domain A）、中间结构域（Domain C）和C端结构域（Domain I）组成。其中，NPC1的C域（NPC1-C）直接与病毒糖蛋白（glycoprotein, GP）相互作用，是介导病毒入侵的关键区域。病毒糖蛋白GP最初合成时为单一多肽，经宿主蛋白酶Furin切割为GP1（外表面部分）和GP2（跨膜部分）。GP1包含受体结合域（receptor binding domain, RBD）、糖帽（glycan cap）和黏蛋白样结构域（mucin-like domain, MLD），其中RBD是与NPC1-C相互作用的核心组件，但其受体结合位点（receptor binding site, RBS）被糖帽和黏蛋白样结构域遮蔽，须经内体蛋白酶L&B切割去除后才能暴露，形成切割型糖蛋白（cleaved GP, GPcl）进而与NPC1-C结合。鉴于RBS在病毒入侵中的关键作用，该位点成为抗埃博拉病毒药物开发的重要靶标。

基于上述病毒入侵机制，研究人员利用NPC1-C与GPcl的相互作用信息，设计能够结合RBS并阻断病毒入侵的肽类结合分子。此前已有研究报道基于NPC1-C环2（loop 2）与EBOV-GP主要接触区域设计的肽类抑制剂在体外对丝状病毒具有强效抑制活性，本研究在此基础上进一步补充了对BDBV的体外测试数据，并开展了体内动物实验以评估其保护效力及探索分子机制。

研究人员为开展本项研究所采用的关键技术方法包括：病毒假型化技术，以HIV-1骨架质粒pSG3ΔEnv构建携带EBOV或BDBV糖蛋白基因的伪型病毒；基于TZM-bl细胞的荧光素酶报告基因检测系统，用于定量评估肽类抑制剂的抗病毒活性；生物安全四级（BSL-4）实验室条件下的复制型病毒抑制实验，采用免疫荧光染色及自动化成像显微镜（Cytation 1）结合CellProfiler图像分析软件检测感染效率；小鼠体内药效学评价，使用鼠适应型EBOV攻击的Balb/c小鼠模型，通过皮下注射给药评估生存率及组织病理学变化；分子对接分析，采用HPEPDOCK 2.0网络程序进行柔性肽-蛋白对接，解析肽与受体结合位点的相互作用模式。

肽类抑制剂体外抑制正埃博拉病毒感染活性评估。研究人员首先评估了线性肽erp1及其环化形式erp1c对BDBV假型病毒的抑制活性。结果显示，erp1和erp1c对BDBV感染均有抑制作用，半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC₅₀）分别为17.89 μM和13.73 μM，其中环化肽erp1c的活性优于线性肽erp1，与此前对EBOV的观察结果一致。

复制型EBOV体外抑制实验验证。为验证肽类抑制剂对活病毒的作用，研究人员选取代表性线性肽erp1在NEIDL的BSL-4实验室进行验证。结果显示，erp1对复制型EBOV的IC₅₀为15.51 μM，与假型病毒数据相当；而序列打乱的对照肽erp1sc无抑制活性，证明肽的特定氨基酸序列对其功能至关重要。

特异性分析。研究人员以环化肽erp1c评估抑制作用的特异性，采用亲嗜性鼠白血病病毒（Amphotropic murine leukemia virus, A-MLV）作为阴性对照。结果表明，erp1c仅对EBOV（IC₅₀ 11.6 μM）和BDBV（IC₅₀ 11.3 μM）有抑制活性，对A-MLV无活性，证实该肽的抑制作用具有正埃博拉病毒特异性，与其靶向NPC1结合位点的设计原理相符。

肽抑制剂突变分析。基于疏水相互作用的结构预测，研究人员推测肽序列中两个苯丙氨酸残基（F7和F8）在与GP之RBS结合中起关键作用。通过将两个苯丙氨酸突变为丙氨酸（FF/AA），研究人员发现线性和环化突变肽的抑制活性均显著降低：线性突变肽erp1aa的IC₅₀从25 μM升至109 μM（约4.3倍变化），环化突变肽erp1caa的IC₅₀从12.6 μM升至38.5 μM（约3.0倍变化），证实这两个疏水残基对结合RBS具有重要贡献。

分子对接分析。研究人员对环化野生型肽erp1c及其突变体erp1caa进行分子对接分析，结果显示野生型中F7和F8确实嵌入RBS深口袋，模拟NPC1天然环2的结合方式；而突变体虽通过V9和Y10重新定位以实现次优结合，但结合能评分显著降低，从分子层面解释了突变导致活性下降的机制。

肽抑制剂体内药代动力学研究。研究人员对线性肽erp1和环化肽erp1c进行了小鼠体内药代动力学（pharmacokinetics, PK）研究。结果显示，erp1的清除率（clearance, CL）、表观分布容积（volume of distribution, V）和半衰期（half-life, T_1/2）分别估计为15.6 L/h、29.8 L和1.32 h；erp1c的CL、V_d和T_1/2分别为3.85 L/h、8.41 L和1.51 h。环化肽erp1c在血浆中表现出比线性肽erp1更高的稳定性，但变异性也更大。

小鼠模型药效学研究。研究人员选取环化肽erp1c和m78abc在鼠适应型EBOV攻击的Balb/c小鼠模型中评估体内保护效果。结果显示，未治疗对照组和m78abc治疗组小鼠均在第6天死亡，而erp1c治疗组8只小鼠中有2只存活至第21天研究终点（存活率25%）。虽然由于样本量限制未能达到传统统计学显著性（p < 0.05），但从如此致命的病毒攻击中获得存活被视为具有生物学意义的积极信号。组织病理学检查显示，非存活动物肝脾呈现典型MA EBOV病变，而存活动物未见MA EBOV样病变且可见淋巴增生。体重监测显示，治疗组与未治疗组在感染初期均出现显著体重下降，但治疗组后期有所恢复。

讨论部分，研究人员指出本研究提供了利用天然配体（如受体）设计靶向病毒RBS的肽类结合分子的实例，体现了配体基抑制剂设计的高合理性和良好特异性。环化肽erp1c优于线性肽erp1的原因在于其更有效地模拟了天然配体NPC1受体的环2结构。鉴于丝状病毒共用NPC1受体入侵细胞，NPC1基抑制剂具有覆盖多种丝状病毒的潜力——本研究中erp1和erp1c对正埃博拉病毒属和正马尔堡病毒属（Orthomarburgvirus）均显示活性，尽管其RBD序列同源性仅48%。

研究人员坦陈该小鼠模型研究尚属初步，存在样本量有限、统计效力不足的问题。此外，给药剂量（约10 mg/kg）相对于低微摩尔级别的IC₅₀可能未达最优，未来需进行剂量优化以提高疗效。体内药代动力学分析也存在局限性，该研究设计为初步探索性分析，未进行正式的PK/PD或暴露-反应关系分析，未来研究将纳入更全面的PK/PD分析，包括评估暴露量与IC₅₀的关系及其与抗病毒结局的关联。

研究人员比较了两种环化肽的体内外表现：m78abc对假型EBOV的IC₅₀为16.1 μM，但体内完全未能保护小鼠；而erp1c的IC₅₀更低（假型EBOV 12.3 μM、野生型EBOV 10.5 μM），体内显示部分保护。这提示提高抑制效力、降低IC₅₀值对于改善体内治疗结局至关重要。

未来优化方向包括：通过基于结构的序列修饰提高肽与RBS的结合亲和力；增强肽的细胞膜穿透能力以促进其到达内体/溶酶体靶点，如添加细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs）以增强膜通透性，或添加磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）以利用细胞表面Tim-1等分子通过巨胞饮途径促进肽的内体/溶酶体靶向递送。

肽类药物相较小分子和蛋白质药物具有毒性低、特异性高、灵活性好等独特优势，在治疗人类疾病中价值日益凸显。对于埃博拉病毒病或马尔堡病毒病（Marburg virus disease, MVD）等丝状病毒疾病，靶向受体结合位点的肽类药物尤为重要，因为丝状病毒共用NPC1受体，可共享相同的入侵阻断策略。研究人员最终总结认为，本研究通过体外和体内数据证实，基于受体的肽设计靶向RBS是?mediate有效的丝状病毒阻断策略，环化肽erp1c为进一步开发抗丝状病毒肽类药物提供了有前景的方向。