通过农工业废水生物转化获得的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种HD-1的细菌发育和抗真菌特性表征

《Fermentation》：Characterization of the Bacterial Development and Antifungal Properties of Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1 Obtained by Bioconversion of Agroindustrial Effluents

　　

作为应用最广泛的生物农药之一，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的大规模生产通常受限于常规培养基的高昂成本。在本研究中，研究人员评估了发酵木薯糊水（EFM）、成熟芒果果肉汁（CM）和腰果苹果汁（JPC）作为苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种HD-1（B. thuringiensis var. kurstaki HD-1）液体发酵的替代底物。理化分析揭示了酸性pH值，并将底物分为两类：CM具有高碳氮比（C/N）、有机物、总糖和蛋白质含量，而EFM和JPC具有较低的C/N比和营养水平。发酵结果表明，JPC支持了最高的生物量产量（8.29 × 10¹³ CFU mL^-1），超过了标准胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基。然而，CM促进了最高的产孢率（1.46 × 10¹³ CFU mL^-1）以及最多的生物活性脂肽——伊枯草菌素（iturins，102.2 mg L^-1）和表面活性素（surfactins，554.7 mg L^-1），超过了TSB。研究人员评估了粗发酵CM、EFM和TSB对白绢病菌（Sclerotium rolfsii）的抗真菌活性。所有样品均显著抑制了病原菌的菌丝生长，且在测试的底物或浓度间无显著差异。本研究突显了苏云金芽孢杆菌发酵的农业废弃物作为针对白绢病菌（S. rolfsii）的经济高效、环境友好型生物防治工具的潜力。

**研究背景、问题与目标**
自20世纪60年代绿色革命以来，化学合成农药在保护作物免受病虫害方面发挥了核心作用，但过度使用导致生态系统破坏、人类健康风险（如内分泌干扰、癌症、神经系统疾病）及病原菌抗药性增强。作为替代方案，生物农药尤其是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）因其广谱杀虫活性、环境安全性和可降解性被广泛使用，占全球生物杀虫剂市场70%以上。然而，Bt的工业生产受限于常规培养基的高成本。同时，农工业废弃物（如木薯加工废水、芒果果肉、腰果苹果汁）大量产生且管理不善，造成环境污染。本研究旨在评估三种农工业液体废弃物作为替代底物生产Bt的可行性，并研究其抗真菌活性，以开发低成本、可持续的生物农药，推动循环生物经济。论文发表在《Fermentation》。

**技术方法（不超过250字）**
研究人员从科特迪瓦亚穆苏克罗（Yamoussoukro）的小规模加工单元采集三种农工业液体废弃物：发酵木薯糊水（EFM）、成熟芒果果肉汁（CM）和腰果苹果汁（JPC）。通过理化分析（pH、有机物、总碳、总氮、总蛋白、总糖及矿物质含量）评估底物特性。采用配备可编程逻辑控制器（PLC）的3 L生物反应器进行分批发酵（30°C，pH 7.0，通气0.2–0.4 L空气/min，搅拌200–250 rpm，溶氧>30%），接种2%（v/v）苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种HD-1（Btk HD-1）预培养物。通过稀释涂板法和热激处理（65°C，15 min）分别计数活细胞和孢子；利用高效液相色谱（HPLC）定量伊枯草菌素和表面活性素。抗真菌活性测试采用培养基掺入法和菌核浸泡法，以白绢病菌（Sclerotium rolfsii）为靶标，测量菌丝生长抑制率。数据经单因素方差分析（ANOVA）和Fisher最小显著性差异（LSD）检验（α=0.05）处理。

**研究结果**
**3.1 农工业废水的理化特性**：通过理化分析，所有底物呈酸性（pH 3.80–4.50）。CM具有最高有机物含量（94.05%）和碳氮比（C/N=78.12），而EFM和JPC的碳氮比及营养水平较低。矿物质分析显示锌、钙、钠含量相对较高（0.11–0.26 mg/kg），未检测到镁。这表明CM作为碳源丰富的底物具有优越潜力。

**3.2 农工业废水的层次聚类分析**：层次聚类分析（HCA）将底物分为两类：第I类仅包含CM（高C/N、总糖、有机物、蛋白质，低矿物质如锰、铁、铜、磷）；第II类包含EFM和JPC（低C/N、低营养水平）。该分类凸显了CM与其他底物的营养差异，表明其更适合Bt生长和代谢物生产。

**3.3 发酵期间活细胞和孢子计数**：通过稀释涂板和热激处理计数，生长曲线普遍呈现四阶段（除CM为三阶段）。JPC支持最高生物量（8.29×10¹³ CFU mL^-1），CM诱导最高孢子密度（1.46×10¹³ CFU mL^-1），而TSB产孢率最低（3.34×10¹² CFU mL^-1）。细胞计数与孢子产量呈显著正相关（r=0.418，p<0.05）。

**3.4 培养基对Btk HD-1菌落形态的影响**：通过宏观观察（ImageJ测量直径、Munsell色卡对照），CM和JPC上的菌落显著更大（平均直径4.7 mm）、平坦、边缘完整、表面光滑亮白，无冷凝水滴；而EFM和TSB上的菌落较小（2.3 mm）、隆起、边缘波状、粗糙、黄色。表明底物组成影响细菌生长形态。

**3.5 伊枯草菌素和表面活性素的产量**：HPLC定量显示，所有培养基中脂肽浓度随时间增加。CM合成的伊枯草菌素（从37.7增至102.2 mg L^-1）和表面活性素（从237.8增至554.7 mg L^-1）最高，超过TSB（伊枯草菌素56.6 mg L^-1，表面活性素389.6 mg L^-1）。EFM产量最低。表面活性素产量始终高于伊枯草菌素，CM中后者是前者的5倍。

**3.6 Btk HD-1对白绢病菌的抗真菌活性**：通过培养基掺入法和菌核浸泡法评估，发酵CM（CMBt）、EFM（EFMBt）和TSB（TSBBt）均显著抑制白绢病菌菌丝生长，且三者间无显著差异（ANOVA，p>0.05）。测试浓度（10%、15%、20%）间也无显著剂量-反应关系，表明最低浓度已足以达到最大抑制效果。

**讨论总结与结论翻译**
讨论部分指出，理化分析显示底物酸性但营养组成差异大，影响细胞生长、产孢和脂肽合成。CM因高碳氮比和丰富的碳水化合物（如芒果残渣）表现出优越性能，这与前人研究一致。孢子形成由碳氮平衡调控，碳源缺乏抑制产孢，氮源耗尽触发毒素合成。细胞与孢子计数间的正相关性表明生物量部分决定产孢潜力，但孢子形成还受环境信号和群体感应调控。抗真菌活性归因于环状脂肽（伊枯草菌素、表面活性素）破坏真菌膜完整性。不同发酵底物间无显著差异，说明该菌株在替代培养基中同样具备代谢活性。无剂量-反应关系可能因最低浓度已达到最小抑制浓度。

**研究结论翻译**：本研究证明了农工业废水作为替代营养培养基支持苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种HD-1（Btk HD-1）生长、产孢和生物活性化合物产生的潜力。对底物的营养分析揭示了基于矿物质组成和理化性质的两类不同底物。活细胞和孢子计数及次生代谢物定量证实，替代培养基——成熟芒果果肉汁（CM）、腰果苹果汁（JPC）和发酵木薯糊水（EFM）——与常规胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基具有竞争力。其中，CM表现出最高的产孢率和最佳的生物活性代谢物（尤其是伊枯草菌素和表面活性素）生物合成。这些脂肽赋予Bt抗真菌和抗菌特性，使其成为番茄病原菌和害虫有前景的生物防治剂。农工业残留物的资源化利用不仅支持可持续废物管理，还提供了循环生物经济框架下生态友好型生物农药生产的经济高效策略。在替代底物和经典实验室培养基中发酵的Btk HD-1产品效果相当，突显了其用于开发经济可及生物防治方案的强大潜力。使用农食品残留物（如发酵木薯水和成熟芒果果肉）符合循环经济和农业生态学原则。这些结果对热带农业系统尤为重要，因为合成投入品获取有限，且土传病害（如白绢病菌引起的病害）严重制约生产力。