树莓RiACO1基因的克隆与功能分析

《Horticulturae》：Cloning and Functional Analysis of the RiACO1 Gene in Raspberry

　　

红树莓果实极易腐烂，且树莓植株因根系浅而对干旱和低温胁迫敏感，这限制了其在寒冷地区的生产及采后利用。在本研究中，研究人员从红树莓（‘Polka’）中克隆了RiACO1，并通过生物信息学分析、亚细胞定位、组织特异性表达、在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的异源过表达以及在白色阶段树莓果实中的瞬时过表达对其进行了分析。RiACO1全长编码序列（coding sequence, CDS）为963 bp，编码一个由320个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白定位于细胞质和细胞核。过表达RiACO1的拟南芥株系在干旱和低温胁迫下表现出更高的存活率，同时伴随脯氨酸含量、叶绿素保留率及抗氧化酶活性的增加，以及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）积累的减少。在树莓果实中，瞬时过表达RiACO1提高了RiACO1转录水平、ACC氧化酶（ACO）活性和乙烯生成量，并与加速软化、花青素积累和叶绿素降解相关。这些结果表明，RiACO1参与乙烯相关的果实成熟过程，并可能有助于非生物胁迫响应；但其在树莓中的直接育种价值需通过稳定的树莓转化或靶向功能缺失方法进一步验证。

**研究背景、现存问题与研究目的**

树莓（Rubus idaeus L.）是一种经济价值较高的小浆果，以其风味、营养品质和生物活性成分而受到重视。然而，树莓果实质地脆弱、采后腐烂迅速、耐贮性差，限制了鲜果市场流通。同时，树莓植株根系浅，在寒冷地区的生产中易受干旱和低温等非生物胁迫的影响。因此，阐明树莓果实成熟和胁迫耐受性的分子基础，对于改善果实品质、耐贮性和环境适应性具有重要意义。

乙烯是一种普遍存在的气体激素，调控植物生长、发育和胁迫响应。其生物合成从甲硫氨酸开始，经过S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）、1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶（ACS）和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）的连续作用，其中ACS和ACO是限速酶。在胁迫条件下，植物产生所谓的“胁迫乙烯”，但乙烯对非生物胁迫耐受性的影响具有物种和情境依赖性。在肉质果实中，乙烯根据呼吸模式和乙烯合成方式将果实分为呼吸跃变型和非呼吸跃变型，乙烯通过多种代谢途径调控果实成熟过程，包括颜色、硬度、风味等品质特性。ACO作为催化乙烯合成最后一步的关键酶，在多种植物中已被鉴定，并参与果实成熟、花发育及非生物胁迫响应。然而，关于红树莓中ACO基因功能的研究相对较少。因此，本研究从红树莓品种‘Polka’中克隆了成熟上调表达的RiACO1基因，并通过拟南芥异源过表达和树莓果实瞬时转化探索其在胁迫抗性和果实成熟中的功能，旨在为后续树莓特异性遗传验证提供初步的功能证据和基础。

**研究结论与意义**

本研究成功克隆了RiACO1基因，通过序列分析、亚细胞定位、组织表达分析、拟南芥异源过表达和树莓果实瞬时过表达，证实RiACO1属于ACO蛋白家族，定位于细胞质和细胞核。异源过表达RiACO1显著提高了拟南芥对干旱和低温胁迫的耐受性，表现为存活率提高、膜损伤减轻、抗氧化酶活性增强、脯氨酸积累增加以及胁迫响应标志基因（如AtCBF1、AtP5CS1、AtNCED3、AtERF15）的上调表达。在树莓果实中，瞬时过表达RiACO1促进了果实成熟相关变化，包括加速软化、花青素积累、叶绿素降解以及可溶性糖和果胶转化。这些结果支持RiACO1参与树莓果实成熟，并表明其在异源系统中与胁迫响应调控相关。该研究为理解树莓果实成熟和胁迫响应的分子机制提供了重要依据，并为未来通过基因工程改良树莓耐贮性和抗逆性奠定了理论基础。论文发表在《Horticulturae》。

**主要关键技术方法**

本研究采用的关键技术方法包括：基于PCR的基因克隆与序列分析（使用DNAMAN、MEGA7.0、ExPASy ProtParam、SMART、SWISS-MODEL等工具进行同源比对、系统发育树构建及蛋白理化性质与结构预测）；农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时表达用于亚细胞定位（激光共聚焦显微镜观察）；定量实时PCR（qRT-PCR）分析RiACO1在树莓不同组织（根、茎、叶、果实）及不同发育阶段（绿色、白色、转色、成熟）的表达模式；花序浸染法（floral-dip）转化拟南芥（哥伦比亚生态型）获得稳定过表达株系，并进行干旱（停水10 d）和低温（?4°C 24 h）胁迫处理及生理指标测定（脯氨酸、叶绿素、MDA、H₂O₂、O₂^?、抗氧化酶活性、相对电导率、DAB/NBT染色）；真空渗透农杆菌介导的树莓白色阶段果实瞬时转化，并进行成熟相关指标测定（乙烯释放量、ACO酶活性、果实硬度、呼吸速率、花青素、叶绿素、果胶、可溶性糖、可滴定酸）。样本来源：树莓品种‘Polka’种植于东北农业大学向阳农场；拟南芥和本氏烟为本实验室保存。

**研究结果**

**3.1 树莓RiACO1基因的克隆与序列分析**

通过PCR扩增、胶回收、克隆和测序成功获得RiACO1全长CDS（963 bp），编码320个氨基酸。理化分析显示该蛋白为亲水性蛋白，理论等电点（pI）为5.20，分子量36.243 kDa。多序列比对表明RiACO1与月季（Rosa chinensis）RcACO1等11种植物ACO同源物具有高度序列相似性，保守结构域分析预测存在典型的ACO家族基序DIOX_N和2OG-FeII_Oxy。系统发育分析显示RiACO1与玫瑰（Rosa rugosa）RrACO1亲缘关系最近，与胡杨（Populus euphratica）PeACO1最远。二级结构预测包含41.88% α螺旋、35.31% 无规卷曲、17.50% 延伸链和5.31% β转角，三级结构建模显示其具有典型ACO蛋白的空间构象。

**3.2 RiACO1蛋白的亚细胞定位分析**

将35S:RiACO1-GFP融合构建体通过农杆菌介导法在本氏烟叶片中瞬时表达，48 h后共聚焦显微镜观察显示，与均匀分布于全细胞的35S:GFP对照相比，35S:RiACO1-GFP的荧光信号主要分布在细胞质和细胞核，表明RiACO1定位于这两个区室。

**3.3 树莓RiACO1基因的表达分析**

qRT-PCR分析显示，RiACO1在树莓根、茎、叶和不同成熟阶段果实中均有表达，但表达水平差异显著。果实中的表达量显著高于其他营养组织（根、茎、叶）。随着果实成熟，RiACO1转录本丰度迅速增加，在完全成熟果实中达到峰值，而在茎和叶中表达水平最低。

**3.4 拟南芥中RiACO1基因过表达的功能分析**

通过花序浸染法获得稳定转基因拟南芥株系，选取三个高表达T3纯合株系（S2、S3、S5）进行胁迫分析。干旱胁迫（25°C停水10 d）后，转基因株系表现出较轻的伤害，复水后存活率（76.3%–78.3%）显著高于野生型（WT, 45.0%）和空载体对照（UL, 50.3%）。DAB和NBT染色显示转基因株系染色强度较弱，表明ROS积累较低；定量分析证实H₂O₂和O₂^?含量显著低于对照。其他生理指标显示，转基因株系MDA含量和相对电导率更低，叶绿素降解更慢，脯氨酸含量和抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性更高。qRT-PCR分析显示干旱胁迫后转基因株系中AtCBF1、AtP5CS1、AtERF15和AtNCED3的转录水平显著高于对照。低温胁迫（?4°C 24 h）后，转基因株系损伤更轻，恢复后存活率（71.6%–78.3%）显著高于WT（28.3%）和UL（23.0%）。ROS积累、生理指标和胁迫响应基因表达趋势与干旱胁迫类似。这些结果表明异源表达RiACO1提高了拟南芥的干旱和低温耐受性，与渗透调节、抗氧化能力和胁迫响应基因激活相关。

**3.5 瞬时过表达RiACO1加速树莓果实成熟相关变化**

在白色阶段树莓果实中瞬时过表达RiACO1，以WT和空载体（UL）果实为对照。在环境条件下每5 h监测表型和成熟相关生理参数，仅使用35 h内的数据（因35 h后部分样品出现霉变）。表型观察显示瞬时过表达RiACO1加速了早期果实着色。RiACO1转录本丰度和ACO酶活性随处理时间增加，从10 h起显著高于对照，表明瞬时过表达成功。生理测定显示，过表达果实在30–35 h硬度降低，35 h呼吸速率升高，10、15、30、35 h乙烯释放量增加。此外，过表达促进了花青素积累和叶绿素降解，并影响果胶、可溶性糖和可滴定酸的动态变化。这些结果表明瞬时过表达RiACO1加速了树莓果实中多种成熟相关的生理变化。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，RiACO1含有2OG-FeII_Oxy和DIOX_N保守结构域，与蓝莓VcACO2等典型ACO蛋白一致，提示其可能发挥ACO家族典型功能。亚细胞定位结果与先前报道的ACO蛋白相符。在拟南芥中，RiACO1过表达株系在干旱和低温胁迫下表现出更轻的损伤和更高的存活率，生理分析表明其维持了更高的叶绿素和脯氨酸含量，增强了抗氧化酶活性，降低了MDA和ROS积累，并通过上调AtCBF1、AtNCED3、AtP5CS1、AtERF15等胁迫响应标志基因的表达，表明RiACO1与CBF相关信号、ABA/脯氨酸相关渗透调节及ERF介导的胁迫响应相关联。在树莓果实中，RiACO1在成熟果实中高表达，瞬时过表达后ACO活性和乙烯生成增加，并加速了软化、花青素积累、叶绿素降解、可溶性糖积累和果胶转化等成熟过程，这与番茄、梨、香蕉等作物中ACO基因促进乙烯合成和成熟的作用一致。综上所述，该研究从树莓中克隆了RiACO1，其全长CDS为963 bp，编码320个氨基酸，含有保守的DIOX_N和2OG-FeII_Oxy结构域，属于ACO蛋白家族。亚细胞定位显示RiACO1分布于细胞质和细胞核。表达分析表明RiACO1在成熟树莓果实中高表达，与果实成熟密切相关。在拟南芥中异源过表达RiACO1提高了干旱和低温耐受性，表现为存活率提高、膜损伤减轻、抗氧化酶活性增强、脯氨酸积累增加以及胁迫响应标志基因（AtCBF1、AtP5CS1、AtNCED3、AtERF15）上调。在白色阶段树莓果实中瞬时过表达RiACO1增加了RiACO1转录本、ACO活性和乙烯生成，并促进了果实软化、花青素积累、叶绿素降解、可溶性糖积累和果胶转化等成熟相关生理变化。总体而言，这些结果支持RiACO1参与树莓果实成熟，并提示其在异源拟南芥系统中与胁迫响应调控相关。