基于集成机器学习和分子模拟的自然产物来源USP7抑制剂筛选用于癌症治疗

《Current Issues in Molecular Biology》：Screening of Natural Product-Derived USP7 Inhibitors for Cancer Therapy via Integrated Machine Learning and Molecular Simulations

　　

泛素化(Ubiquitination)是一个关键的细胞蛋白质调控过程，与包括癌症在内的多种疾病相关。去泛素化酶(Deubiquitinases, DUBs)能够逆转泛素化过程，从而提供一种治疗策略。USP7作为DUB家族的一员，因其在使p53蛋白失稳中的作用而成为肿瘤学中的一个关键靶点，小分子抑制剂能够恢复p53活性并抑制肿瘤生长。在本研究中，研究人员整合了基于机器学习(ML)的筛选方法与分子对接和分子动力学(MD)模拟，以识别潜在的USP7小分子抑制剂。基于ML的筛选从2301种天然化合物库中鉴定出22个活性分子。在这22个活性化合物中，仅有15个化合物满足药效团相似性规则。随后，分子对接根据结合亲和力和相互作用筛选出三种化合物：PubChem 162957515、114917和442879作为潜在抑制剂。进一步，研究人员进行了MD模拟和MM-PBSA分析以评估复合物的稳定性和动态行为。分子力学-泊松-玻尔兹曼表面积(MM-PBSA)结合能计算显示，化合物PubChem 114917和162957515表现出强结合亲和力，分别为-20.98 kcal/mol和-18.68 kcal/mol，这表明这些化合物可作为开发抗癌治疗药物的有前景的抑制剂。

**论文解读文章**

**1. 研究背景、存在问题与研究目的**
蛋白质泛素化(Ubiquitination)是真核生物中调控多种生理过程的重要机制，包括受损或错误折叠蛋白质的清除、细胞周期进程和信号传导。泛素化过程由E1、E2、E3酶依次激活并转移泛素蛋白至底物蛋白，标记其命运，通常通过26S蛋白酶体导致降解。去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes, DUBs)能够切除泛素，打破泛素与蛋白质之间的肽键，从而逆转泛素化。泛素化与去泛素化之间的平衡受到严格调控；其失调可引起异常癌症通路激活、炎症中蛋白质复合物组装缺陷以及蛋白质错误折叠，均对细胞功能产生负面影响。人类中已鉴定出约100种DUBs，主要分属金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶两大家族。

USP7（泛素特异性蛋白酶7）是最大DUB家族USP的成员，于1997年首次被鉴定为即刻早期蛋白的伴侣，主要定位于细胞核。它在稳定参与DNA修复、激酶调控、转录、表观遗传基因表达和病毒感染的多种蛋白质中发挥关键作用。以往研究表明，多个USPs具有重要生物学功能，使其成为有吸引力的治疗靶点。USP7因其在调控肿瘤抑制因子p53中的功能而成为潜在的肿瘤学靶点。此外，USP7在多种癌症中过表达，如骨髓瘤、前列腺癌、胶质瘤、肝细胞癌和卵巢癌。已有研究探索了针对p53-MDM2相互作用等下游通路的计算机辅助药物发现方法，强调了泛素系统的治疗相关性。

泛素连接酶MDM2促进肿瘤抑制因子p53的降解。USP7耗竭会催化包括MDM2在内的USP7底物的泛素化，随后MDM2经蛋白酶体变性可稳定p53，从而刺激细胞周期停滞和凋亡。USP7的上调还激活NOTCH和WNT/β-catenin等细胞信号通路，促进癌细胞增殖。因此，抑制USP7可增强其他底物的泛素化，调节细胞生理并重新激活p53通路，从而抑制癌细胞生长，这为多种癌症的治疗提供了潜在益处。

传统药物发现方法虽然基础，但在发现新型化合物方面存在范围和能力上的局限性。近年来，人工智能模型极大革新了药物发现领域。鉴于单一方法流程在虚拟筛选中的局限性，本研究采用了混合机器学习(ML)和计算机辅助药物发现(CADD)的方法。该混合方法相较于传统药物发现方法具有显著优势。本研究旨在通过集成基于ML的虚拟筛选与分子动力学模拟，识别靶向USP7催化核心结构域的潜在抑制剂，为癌症治疗提供新途径。

**2. 关键技术与方法**
研究人员主要采用了以下关键技术方法：
（1）数据获取与处理：从BindingDB数据库检索已知USP7抑制剂，并通过DUD-E数据库生成诱饵(decoy)分子，利用RDKit计算30种分子描述符，并应用合成少数过采样技术(SMOTE)处理类别不平衡。
（2）主成分分析(PCA)：使用Scikit-learn对描述符进行降维，提取主成分。
（3）机器学习模型构建与筛选：构建并比较支持向量机(SVM)、K近邻(KNN)、朴素贝叶斯(NB)和随机森林(RF)等模型，采用10折交叉验证评估性能，选择最优RF模型用于筛选来自MPD3库的2301种天然化合物；随后通过Lipinski五规则评估类药性。
（4）分子对接：使用AutoDock Vina将筛选出的化合物对接到USP7的泛素结合位点（PDB ID: 5UQX），评估结合亲和力与相互作用。
（5）分子动力学(MD)模拟：利用GROMACS 2024和charmm36力场，对候选化合物-蛋白质复合物进行100 ns的MD模拟，分析均方根偏差(RMSD)、均方根波动(RMSF)、溶剂可及表面积(SASA)、回转半径(Rg)及主成分分析(PCA)。
（6）结合自由能计算：采用MM-PBSA方法计算最后25 ns的结合自由能。

**3. 研究结果**
**3.1 数据检索与处理**
从BindingDB获得965个已知USP7活性抑制剂，DUD-E生成2872个诱饵分子，合并共3837个化合物，按70%训练集、30%测试集划分，并使用RDKit计算特征。

**3.2 基于主成分分析的机器学习特征降维**
PCA显示第一主成分(PC1)解释99.44%的方差，PC2仅0.56%，表明PC1捕获了绝大部分关键信息。

**3.3 模型评估**
随机森林(RF)表现最优，准确率96%，马修斯相关系数(MCC)0.90，AUC达0.99，显著优于SVM、KNN和朴素贝叶斯。RF在测试集上准确率98%，灵敏度95.8%，特异性98.6%。

**3.4 基于ML模型的新数据集筛选与适用域分析**
应用RF模型筛选2301种天然化合物，预测22个活性分子，去除3个重复后得19个活性化合物。经Lipinski五规则筛选，15个化合物满足类药性标准。适用域(AD)分析表明19个化合物中17个位于模型可靠预测空间内。

**3.5 分子对接结果**
对接验证中，重新对接的天然配体GNE6776的RMSD为1.1 ?。对接后筛选出三个化合物：PubChem 162957515、114917和442879，结合能分别为-11.3、-10.6和-10.2 kcal/mol，均优于GNE6776的-9.9 kcal/mol。这些化合物与关键残基（如ARG301、GLU345、ASP346等）形成氢键。

**3.6 候选化合物的PASS在线分析**
PASS分析预测三个化合物均具有抗肿瘤活性（Pa>0.2），包括针对乳腺癌、宫颈癌、肉瘤和脑癌的活性，显示广谱抗癌潜力。

**3.7 分子动力学模拟**
RMSD分析显示PubChem 442879平均RMSD最低（0.20 nm），114917和GNE6776分别为0.23 nm，162957515最高（0.27 nm）。RMSF分析显示所有复合物残基波动低于0.3 nm，但环区D374-E388、P413-D416等波动较大。SASA分析显示PubChem 442879和162957515具有最低SASA值，表明更紧密的结构。回转半径(Rg)表明PubChem 442879和114917具有最低Rg值。

**3.8 模拟后相互作用分析**
PubChem 162957515和114917在100 ns模拟后仍稳定结合在USP7活性位点内，而PubChem 442879在模拟过程中脱离活性位点。

**3.9 氢键分析**
PubChem 162957515持续形成1-3个氢键，偶尔达4个；PubChem 114917形成1-2个氢键；PubChem 442879仅形成少量短寿命氢键，显示弱结合。

**3.10 模拟后主成分分析**
PCA显示apo-USP构象分布更广、更分散；GNE6776和162957515复合物分布紧密集中；114917和442879分布相对致密但略分散，表明配体结合稳定了USP7构象。

**3.11 三个复合物的MD模拟重复**
第二轮100 ns模拟中，三个候选化合物的RMSD曲线与第一轮高度一致，验证了模拟的可重复性。PubChem 162957515和114917在模拟结束时仍稳定结合，而PubChem 442879再次脱离。

**3.12 MM-PBSA计算**
MM-PBSA结合自由能显示：GNE6776为-25.45 kcal/mol，PubChem 114917为-20.98 kcal/mol，162957515为-18.68 kcal/mol，而442879仅为-0.18 kcal/mol，证实前两者结合力强，后者几乎无结合。残基能量分解显示ARG301在两个复合物中均为关键稳定残基。

**4. 讨论**
本研究利用基于机器学习筛选方法寻找靶向USP7的潜在抑制剂。训练好的RF模型用于筛选天然产物库MPD3，通过类药性过滤、分子对接、MD模拟和MM-PBSA分析，最终鉴定出三个候选化合物。对接分析显示三个化合物与天然抑制剂GNE6776占据相同的变构口袋，并与关键残基ARG301、ASP346、ASP349相互作用，这与已报道的USP7变构抑制剂结合机制相似。MD模拟和MM-PBSA证实PubChem 114917（丹参酮I，Tanshinone I）和162957515具有稳定的蛋白质-配体相互作用和强结合亲和力。文献报道丹参酮I具有抗白血病、乳腺癌、抗炎等活性，而Hinokinin（化合物442879）具有抗增殖、神经保护等活性。本研究首次从计算角度揭示了它们与USP7的结合机制。但本工作基于计算机模拟，需进一步体外、体内实验验证其抑制活性、选择性和安全性。

**5. 结论翻译**
本研究旨在通过靶向USP7作为可能的药理学靶点来探索治疗方法。采用集成策略筛选天然化合物库中的USP7抑制剂，随后进行MD模拟和MM-PBSA自由能计算。利用机器学习模型优先筛选数据集中的生物相关化合物，并随后通过分子对接、分子动力学模拟和MM-PBSA分析进行评估。分子对接分析揭示了三种潜在结合剂：PubChem 162957515、114917和442879，基于有利的结合能分数和与USP7活性位点关键残基的相互作用。MD模拟和MM-PBSA证实了USP7抑制剂复合物的稳定性。MD模拟显示化合物PubChem 114917和162957515强烈稳定了USP7结构，在模拟期间产生低结构波动和极佳稳定性。MM-PBSA结果显示化合物PubChem 114917和162957515具有高结合亲和力，表明它们是有效的USP7抑制剂。在所识别的化合物中，PubChem 114917和162957515表现出最有利的计算特征，包括稳定的蛋白质-配体相互作用和强结合亲和力。这些发现表明，所识别的化合物可作为开发新型USP7抑制剂的有前景的起点。虽然计算结果为PubChem 114917和162957515的抑制潜力提供了坚实基础和宝贵的预测见解，但仍需通过体外和体内研究进行实验验证，以确认其活性、评估药理学性质并评估其在癌症及其他USP7相关疾病中的治疗相关性。