《Genes》：Genome-Wide Analysis of the Banana NBS Gene Family and Expression Profiling of the Fusarium Wilt Resistance Gene MamRGA2 in Response to Defense-Related Phytohormones
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背景/目的：香蕉（Musa spp.）生产受到由尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，Foc TR4）引起的镰刀菌枯萎病的严重威胁，凸显了鉴定抗性遗传决定因子的
背景/目的：香蕉（Musa spp.）生产受到由尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，Foc TR4）引起的镰刀菌枯萎病的严重威胁，凸显了鉴定抗性遗传决定因子的必要性。方法：研究人员在野生香蕉（Musa acuminata ssp. malaccensis）中进行了NBS基因的全基因组分析，包括系统发育、染色体和微共线性分析。对MamRGA2的基因组环境和启动子区域进行了表征，通过RT-qPCR评估了其对防御相关植物激素的响应，并通过同源建模预测了其蛋白质结构。结果：共鉴定出118个NBS基因。值得注意的是，研究人员首次在香蕉中报道了两个编码具有整合结构域（IDs）的蛋白质的NBS基因，分别对应一个ATP结合盒（ABC）转运蛋白和一个核因子Y亚基A（NF-YA）转录因子。染色体定位显示，NBS基因在3号染色体上显著富集，该染色体上存在与Foc TR4抗性相关的NBS基因MamRGA2。RT-qPCR分析表明，在抗性野生基因型中，MamRGA2受外源茉莉酸甲酯（MeJA）强烈诱导，但在易感的Cavendish品种中则不然，这一模式与两个基因型间启动子序列的差异相关。结构建模提示，MamRGA2蛋白具有与类抗病小体（resistosome）结构一致的特征。结论：总体而言，这些发现扩展了当前对香蕉NBS基因多样性的认识，并为未来旨在阐明Foc TR4抗性分子机制的研究提供了框架。
香蕉（Musa spp.）是全球重要的粮食作物，年产量约1.83亿吨，在热带和亚热带国家的粮食安全与经济发展中发挥关键作用。然而，由尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，Foc TR4）引起的镰刀菌枯萎病严重威胁香蕉生产。该土传真菌侵染包括Cavendish品种在内的易感香蕉根部，导致维管束枯萎和植株死亡。由于Foc TR4厚垣孢子在土壤中可存活数十年且化学防治效果不佳，亟需替代策略。利用抗性（R）基因激活先天免疫（如效应子触发免疫，ETI）是可持续解决方案之一，其中核苷酸结合富亮氨酸重复（NLR）蛋白是最大的一类R蛋白。香蕉中仅有少数抗性基因被克隆，其中MamRGA2是迄今唯一经田间验证对Foc TR4具抗性的基因。然而，该基因在NBS基因家族中的基因组环境、调控特征和结构特性尚不明确。为此，研究人员对野生香蕉（Musa acuminata ssp. malaccensis）进行NBS基因家族的全基因组分析，旨在扩展对香蕉NBS基因结构的认知，并深入解析MamRGA2的分子基础。该论文发表在《Genes》。
研究人员开展的工作与结论：共鉴定出118个NBS基因，首次报道两个含整合结构域（IDs）的NBS基因（分别编码ABC转运蛋白和NF-YA转录因子），染色体3号显著富集NBS基因并包含MamRGA2；RT-qPCR证实MamRGA2在抗性野生型中受MeJA强诱导，而在易感Cavendish品种中不诱导，与启动子差异相关；结构模型显示MamRGA2可能形成五聚体抗病小体。这些发现为理解香蕉抗Foc TR4机制提供了新资源。
主要关键的技术方法：1）基于隐马尔可夫模型（HMM）的NBS基因注释（HMMsearch，PF00931）及SMART/InterProScan验证；2）系统发育分析（邻接法，MEGA v11，1000次bootstrap）；3）染色体分布与基因簇分析（MG2C v2，簇间距≤200 kb）；4）微共线性分析（JCVI toolkit，MCScan，LAST比对）；5）RT-qPCR检测基因表达（StepOnePlus?系统，SYBR Green，2
-ΔΔCt法）；6）启动子顺式元件分析（PlantCARE数据库）；7）同源建模预测蛋白结构（SWISS-MODEL，以拟南芥ZAR1抗病小体为模板，PDB: 6J5T）。样本来源：M. acuminata ssp. malaccensis（ITC1060）和M. acuminata cv. Grand Nain（AAA组，Cavendish亚组）经体外培养。
研究结果：
**3.1 香蕉NBS基因的鉴定**：全基因组分析鉴定出118个编码NBS结构域蛋白的基因，约占全部预测基因的0.32%。亚家族分类显示79个（66.94%）为典型CC-NBS-LRR蛋白，包括MamRGA2。首次发现两个含整合结构域（IDs）的NBS蛋白——分别对应ABC转运蛋白（位于N端）和NF-YA转录因子（位于N端），均属于ID-CC-NBS-LRR亚家族。另鉴定出一个RPW8-NBS-LRR（RNL）基因，为先前香蕉研究未报道。
**3.2 NBS基因的结构与系统发育分析**：基因结构分析显示外显子-内含子组织变异大，55个基因（46.6%）无内含子（含MamRGA2）。保守基序分析鉴定出8个主要基序，分别对应CC、NBS和LRR结构域。系统发育分析将118个蛋白分为9个主要分支（I-IX），MamRGA2位于分支III，两个含ID蛋白位于分支VII。与拟南芥共166个NBS蛋白对比，所有香蕉NBS蛋白与非TIR型分支聚类，支持单子叶植物中TIR通路丢失。与70个实验验证R基因（来自23种植物）的系统发育分析显示，MamRGA2与番茄I2（抗F. oxysporum f. sp. lycopersici）聚类于分支XII，邻近甜瓜Fom-2（抗F. oxysporum f. sp. melonis），提示功能保守性。
**3.3 香蕉NBS蛋白的亚细胞定位预测**：预测显示核定位最多（56个），其次为质膜（27个）、胞质（22个）。MamRGA2主要定位于胞质。含ABC转运蛋白ID蛋白预测定位于质膜，含NF-YA ID蛋白定位在细胞核。
**3.4 NBS基因的染色体分布**：118个NBS基因在11条染色体上分布不均，3号染色体上最多（31个，26.3%），MamRGA2作为单拷贝位于其近上端，距最近NBS基因约1.6 Mb。根据Jupe等标准，鉴定出23个簇（87个基因，74%），主要位于3号染色体（28个）等。
**3.5 MamRGA2座位侧翼基因及微共线性分析**：MamRGA2上下游各200 kb区域内鉴定出50个基因，其中22个（44%）与生物胁迫响应相关（如钙调蛋白-2、E3泛素连接酶、NAC/EIN3/WUSCHEL转录因子等），8个（16%）与 abiotic胁迫相关。微共线性分析显示M. acuminata cv. Baxijiao中存在3个MamRGA2直系同源基因，其中BXH1_00016606-R1与MamRGA2同源性最高（97.06%），且4个侧翼基因在Baxijiao中缺失（包括一个importin类似蛋白）。
**3.6 防御激素SA和MeJA处理下MamRGA2的表达分析**：RT-qPCR显示，野生基因型中MamRGA2基础表达高于Cavendish品种。SA处理显著抑制MamRGA2表达，而MeJA处理诱导其上调20.47倍（p<0.05）；Cavendish品种中MacRGA2在SA或MeJA处理后均未上调。标记基因MaDLO1（SA通路）和MaLOX1（JA通路）证实处理有效。
**3.7 MamRGA2与MacRGA2启动子区域比较**：点阵图显示近端启动子区（-1000至-1 bp）高度保守（88.11%同源性），远端区（-2000至-1000 bp）高度分化（24.62%同源性）。在野生型启动子中鉴定到两个MeJA响应顺式元件（TGACG和CGTCA基序各两个拷贝），而在Baxijiao中仅各一个拷贝，另含两个CATGTG和一个CACGTT基序（与bHLH识别相关），野生型中缺失。
**3.8 预测的MamRGA2抗病小体三维结构**：同源建模（模板：拟南芥ZAR1五聚体抗病小体，PDB 6J5T）显示MamRGA2形成对称的五聚体，CC结构域向中心定向，LRR结构域向外伸展，与激活态CNL抗病小体特征一致。
**3.9 茉莉酸介导MamRGA2表达抗Foc TR4的假设模型**：基于数据提出模型：Foc TR4可能分泌或诱导宿主产生茉莉酸（JA），JA积累可能拮抗水杨酸（SA）介导的系统获得抗性（SAR），但在抗性野生型中，JA响应顺式元件使MamRGA2快速转录激活，可能通过形成抗病小体及产生活性氧（ROS）实现有效免疫。
**讨论与结论**：
讨论部分指出，本研究鉴定出118个NBS基因，多于以往报道，方法差异和注释改进可能解释此差异。首次发现RNL基因和两个含ID的NBS基因（ABC转运蛋白型和NF-YA型），后者可能作为分子诱骗扩展效应子识别能力。染色体3号高度富集NBS基因，而MamRGA2作为单拷贝存在，与近端基因环境富含信号转导和防御相关基因（如钙调蛋白、E3泛素连接酶、转录因子等）构成免疫相关微环境。微共线性显示Cavendish品种中丢失了4个基因（包括importin同源物），可能影响免疫能力。表达差异与启动子结构相关，Cavendish品种中MacRGA2对MeJA不响应可能由启动子元件差异导致，这种不可诱导性可能是驯化中选择性副产物。JA信号在香蕉免疫中具核心作用：外源MeJA可诱导抗性，且农杆菌胭脂碱合酶（nos）启动子（用于驱动转基因MamRGA2表达）也是MeJA诱导的。鉴定出的MeJA响应顺式元件（TGACG、CGTCA等）为后续CRISPR编辑提供靶点。
**研究结论（翻译）**：本研究全面更新了香蕉NBS基因的多样性和基因组组织。首次在香蕉中鉴定出两个含整合结构域的NBS基因（分别对应ABC转运蛋白和NF-YA转录因子），还发现一个先前未报道的RNL型基因，拓宽了Musa基因组中NBS亚家族的种类。3号染色体因高密度NBS基因和存在抗性基因MamRGA2而突出，凸显其在抵御Foc TR4及其他病原体中的相关性。值得注意的是，该基因在野生基因型M. acuminata ssp. malaccensis中受MeJA诱导，但在驯化的Cavendish品种中不诱导，这或许与启动子结构差异有关。这些结果为研究含整合结构域NBS基因的功能及MeJA诱导MamRGA2表达的调控机制开辟了新途径。这些工作将为香蕉抗病机制提供新见解，并支持针对Foc TR4及其他病原体的新型育种策略。
