铁限制性转录组分析揭示嗜水气单胞菌鲑亚种 SRW-OG1 株 `fhuB` 基因调控毒力的机制

《Aquaculture Reports》：Mechanisms underlying the virulence regulation of Aeromonas salmonicida SRW-OG1 fhuB gene revealed by an iron-limited transcriptomic analysis

　　

铁是细菌生存与致病性所必需的微量营养元素。本研究旨在探讨铁限制如何影响重要病原菌嗜水气单胞菌鲑亚种 SRW-OG1 的毒力调控，重点解析调控该菌毒力的 `fhuB` 基因之分子机制。研究人员对铁限制条件下培养的嗜水气单胞菌鲑亚种 SRW-OG1 进行了转录组测序，并采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）及相关毒力表型分析进行验证。研究从转录组数据中鉴定到高表达的 `fhuB` 基因，该基因参与 Fe³⁺-羟肟酸型铁载体（hydroxamate siderophores）转运系统，并通过同源重组技术构建了 `ΔfhuB` 突变株。结果显示，在铁限制条件下，嗜水气单胞菌鲑亚种 SRW-OG1 中共鉴定到 1409 个差异表达基因（DEGs），其中 988 个上调、577 个下调。基因本体论（GO）富集的主要条目包括代谢过程、膜及转运活性。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集的主要通路包括核糖体以及铁载体类非核糖体肽生物合成。值得注意的是，铁限制显著增强了嗜水气单胞菌鲑亚种 SRW-OG1 的胞外酶活性，以及生物被膜形成、趋化和运动能力。在铁限制条件下，`ΔfhuB` 菌株上述毒力相关表型均显著降低，包括运动能力下降 18.7%、黏附能力下降 17.6%、趋化能力下降 43.2%。此外，与 SRW-OG1 相比，感染 `ΔfhuB` 菌株的点带石斑鱼 *Epinephelus coioides*（橙点石斑鱼）累积死亡率降低 60%，表明其对 *E. coioides* 具有显著保护效应。研究表明，嗜水气单胞菌可通过全局性重编程其转录组并激活 FhuB 介导的铁载体转运系统以适应铁限制环境。铁影响嗜水气单胞菌鲑亚种 SRW-OG1 毒力的多个方面，而 `fhuB` 基因在铁限制条件下调控该菌毒力中发挥关键作用。本研究为铁依赖性致病机制提供了机制性见解，并为水产养殖病害防控鉴定了潜在靶点。

该论文发表于《Aquaculture Reports》，围绕水产重要病原菌嗜水气单胞菌鲑亚种（*Aeromonas salmonicida*）在缺铁环境中的致病调控展开。研究背景在于，铁是细菌呼吸、DNA 合成及氧化应激抵抗所必需的微量元素，但宿主体内游离铁含量极低，致病菌必须通过高效摄铁系统与宿主竞争铁资源，才能维持生长、定植和致病。既往研究已表明，嗜水气单胞菌的铁获取系统、鞭毛、胞外产物及黏附能力与其毒力密切相关，但在该菌中，Fe³⁺-羟肟酸型铁载体摄取系统（Fhu system）内膜转运蛋白 `fhuB` 如何将铁摄取与毒力调控联系起来，仍缺乏清晰机制解释。因此，研究人员开展本项研究，目的是在模拟宿主体内低铁压力的条件下，系统解析该菌的转录响应特征，并进一步明确 `fhuB` 在毒力调控中的功能与意义。

研究人员以分离自患病点带石斑鱼（*Epinephelus coioides*）的嗜水气单胞菌鲑亚种 SRW-OG1 为研究对象，在无铁添加的 IMDM 培养基中建立体外铁限制模型，并以补加 Fe³⁺ 的 IMDM 作为对照。结果表明，铁限制显著抑制该菌生长，但同时诱导广泛的转录重塑。转录组测序显示，大量与代谢、膜结构、转运、核糖体及铁载体类非核糖体肽合成相关的基因发生显著改变，提示该菌在低铁条件下启动了系统性的代偿适应反应。尤其值得关注的是，参与 Fe³⁺-羟肟酸型铁载体转运的 `fhuB` 基因显著上调，成为后续功能研究的核心靶点。

在技术方法上，研究主要采用以下几类关键手段：其一，以 SRW-OG1 在铁丰富与铁限制条件下的对数生长期菌体为样本，进行 RNA-seq（转录组测序）并结合 GO、KEGG 富集分析筛选差异表达基因；其二，采用 RT-qPCR 对代表性差异基因及 `fhuB` 表达变化进行验证；其三，利用同源重组构建 `ΔfhuB` 缺失株，并构建回补株 `C-ΔfhuB`；其四，结合胞外酶活性、生物被膜、运动性、趋化性、黏附性、胞内铁含量测定及点带石斑鱼人工感染试验，对 `fhuB` 的生物学功能进行表型验证。样本来源包括实验室保存的 SRW-OG1 菌株以及养殖场获取的健康点带石斑鱼。

在研究结果部分，论文首先在“3.1. Effect of iron-limited on the growth of *A. salmonicida* SRW-OG1”中指出，铁限制显著抑制 SRW-OG1 的生长。通过生长曲线比较可见，培养早期两组差异不明显，但 4 h 之后低铁组生长持续受抑，这为后续在相同对数期进行转录组比较提供了基础。

在“3.2. Samples relationship and DEGs analysis”中，主成分分析（PCA）显示铁丰富组与铁限制组样本清晰分离，组内重复聚类紧密，说明测序数据重复性良好、组间差异明确。研究共鉴定出 1409 个差异表达基因，约占已注释基因的 34.73%，表明低铁环境对该菌代谢网络和生理状态产生广泛影响。随后通过 RT-qPCR 对随机选取的上调与下调基因进行验证，结果与 RNA-seq 一致，支持转录组分析的可靠性。

在“3.3. Functional enrichment analysis of DEGs based on GO terms”中，研究显示差异表达基因主要富集于生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）三大类 GO 条目。显著富集内容包括代谢过程、定位、刺激应答、催化活性、结合活性、转运活性、膜及膜组分等，说明铁限制不仅影响营养代谢，还影响细胞膜相关功能及物质运输过程。

在“3.4. KEGG pathway enrichment analysis”中，研究人员发现差异基因涉及 117 条 KEGG 通路，其中核糖体通路富集最显著，代谢通路涉及基因数量最多；此外，精氨酸生物合成、支链氨基酸降解、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢及铁载体类非核糖体肽生物合成等通路亦显著富集。这一结果提示，在低铁压力下，SRW-OG1 会重塑蛋白质合成与代谢活动，并增强铁载体相关合成能力，以提高摄铁效率。

在“3.5. Verification of transcriptomic data and virulence-related phenotypes”中，研究进一步将转录变化与毒力表型联系起来。比较转录组中与分泌系统、溶血、两组分系统、运动性、趋化性和生物被膜形成相关的基因后，研究人员检测了相应表型，结果发现铁限制显著增强多种胞外酶活性，包括蛋白酶、酪蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、卵磷脂酶及溶血活性；同时，生物被膜形成能力、半固体平板运动能力以及对点带石斑鱼黏液的趋化能力均明显增强。该部分结果说明，低铁并不只是限制生长，还能激活与宿主定植和组织损伤相关的多种毒力表型。

在“3.6. Expression of `fhuB` gene under different environments conditions”中，研究人员检测了不同 pH、温度和铁条件下 `fhuB` 的表达。结果显示，`fhuB` 在 pH 5 条件下显著升高，在 pH 8 条件下降低；温度从 18 ℃ 升至 28 ℃ 时表达下降，在 37 ℃ 时再次升高；在铁限制条件下则明显上调，与转录组结果一致。由此可见，`fhuB` 不仅响应铁可利用性，还对酸碱度与温度变化敏感，提示其可能参与多环境信号整合下的适应过程。

在“3.7. Construction of `ΔfhuB` and `C-ΔfhuB` strains of *A. salmonicida* SRW-OG1”中，研究通过同源重组将全长 1983 bp 的 `fhuB` 替换为卡那霉素抗性片段，并利用质粒回补获得 `C-ΔfhuB`。PCR、测序与遗传稳定性检测证实缺失株和回补株构建成功，为后续功能分析提供了实验基础。

在“3.8. Growth curves of the `ΔfhuB` and `C-ΔfhuB` strains”中，研究显示在铁丰富条件下，野生株、缺失株和回补株生长差异不显著；而在铁限制条件下，`ΔfhuB` 生长明显减弱，回补株呈部分恢复。该结果说明 `fhuB` 对 SRW-OG1 在低铁环境中的生长适应具有重要作用。

在“3.9. Enzyme activity of extracellular product of the `ΔfhuB` and `C-ΔfhuB` strains”中，研究发现，在铁限制条件下，`ΔfhuB` 的蛋白酶、酪蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、卵磷脂酶和溶血活性均显著低于野生株，而在铁丰富条件下差异不明显。这说明 `fhuB` 是低铁环境下胞外毒力产物活化的重要调控因素之一。

在“3.10. Motility test of the `ΔfhuB` and `C-ΔfhuB` strains”中，缺失 `fhuB` 后菌株在铁限制条件下的集落扩散直径明显缩小，运动能力下降 18.7%，而回补后恢复至接近野生株水平。该结果表明 `fhuB` 对低铁条件下的运动性维持具有关键作用。

在“3.11. Adhesion assay of the `ΔfhuB` and `C-ΔfhuB` strains”中，`ΔfhuB` 在铁限制和铁丰富条件下对点带石斑鱼黏液的黏附能力均显著下降，其中铁限制下下降更为明显。说明 `fhuB` 不仅参与低铁适应，也与黏附相关毒力机制密切相关，是少数在富铁条件下仍表现明显表型差异的指标之一。

在“3.12. Chemotaxis assay of the `ΔfhuB` and `C-ΔfhuB` strains”中，`ΔfhuB` 在铁限制条件下的趋化能力显著下降，而回补株恢复，提示 `fhuB` 参与细菌对宿主相关化学信号的响应过程。

在“3.13. Biofilm formation assay of the `ΔfhuB` and `C-ΔfhuB` strains”中，研究通过结晶紫染色发现，`ΔfhuB` 在铁限制条件下形成生物被膜的能力显著减弱，而铁丰富条件下无明显差异，说明 `fhuB` 对低铁环境中的群体定植和表面附着具有促进作用。

在“3.14. Effect of `fhuB` on intracellular iron content of *A. salmonicida*”中，原子吸收分光光度法检测显示，铁限制条件下 `ΔfhuB` 的胞内铁含量显著低于野生株和回补株。这一结果从生理层面直接证明，`fhuB` 是 SRW-OG1 获取胞内铁的重要组成部分，其缺失会削弱细菌摄铁效率。

在“3.15. Virulence comparison between the `ΔfhuB` and SRW-OG1 strains to *E. coioides* infection trial”中，人工感染试验表明，野生株感染点带石斑鱼后死亡迅速，至第 5 天累积死亡率达 100%；而 `ΔfhuB` 组死亡出现延迟，至第 5 天累积死亡率为 60%，且存活个体维持至实验结束。该结果说明，`fhuB` 缺失可显著削弱 SRW-OG1 的体内致病力。

讨论部分围绕“铁限制—摄铁系统—毒力增强”这一主线展开。研究人员指出，宿主体内低铁环境是病原菌必须克服的核心限制因素，SRW-OG1 在铁限制下通过全局性转录重编程提高铁获取能力，包括上调铁载体类非核糖体肽生物合成相关基因，以及 TonB 依赖型受体、ABC 转运系统等参与铁或铁载体转运的基因。与此同时，低铁还增强了胞外酶活性、生物被膜形成、运动性和趋化性，表明铁限制会同步提升多维度毒力相关表型。围绕 `fhuB` 的功能验证进一步说明，作为 Fhu 系统中的关键膜转运组分，`fhuB` 与胞内铁积累、低铁生长适应及多种毒力表型维持密切相关。尤其在铁限制条件下，`fhuB` 缺失造成一系列致病相关能力下降，并最终导致人工感染模型中的毒力减弱。因此，该基因不仅是细菌应对低铁压力的核心功能元件，也是潜在的病害防控分子靶点。

研究结论部分可译为：本研究验证并解析了嗜水气单胞菌鲑亚种 SRW-OG1 在铁限制胁迫下的转录变化，包括与铁载体相关的非核糖体肽生物合成，以及多种参与铁获取与转运蛋白编码基因的显著上调。在铁限制条件下，SRW-OG1 中与铁载体合成、分泌和转运相关的基因被激活，这构成其获取铁的重要策略之一。研究结果表明，铁可利用性影响该菌胞外产物活性，包括蛋白酶、酪蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶和溶血活性；同时也影响其趋化能力、运动能力及致病性。此外，在铁限制条件下，`fhuB` 基因参与 SRW-OG1 的多种生理功能，如定位、生物被膜形成和趋化能力，并在调控其毒力方面发挥重要作用。