在乳腺癌细胞中过度表达工程化人工核酸酶L29E肌红蛋白及其功能影响

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》：Overexpression of an engineered artificial nuclease L29E myoglobin in breast cancer cells and its functional consequences

　　

Zi-Lei He|Li-Juan Sun|Shu-Qin Gao|Ying-Wu Lin

中国湖南衡阳421001，华南大学化学与化工学院

摘要

三阴性乳腺癌由于缺乏有效的治疗靶点，预后较差，因此亟需新的干预策略。本研究聚焦于一种经过工程改造的人工核酸酶——L29E肌红蛋白，该蛋白在结合镁离子后能形成异核的Mg²⁺-H₂O-血红素结构，并具有DNA切割活性。我们在三阴性乳腺癌细胞系MDAMB231中过表达L29E肌红蛋白，系统评估了其对细胞生理功能的影响。研究结果表明，在镁离子存在下，过表达的L29E肌红蛋白会显著导致DNA损伤和线粒体膜电位下降，进而引发G1期细胞周期停滞、caspase-9/caspase-3级联反应的激活，最终促使细胞凋亡。这些发现证明了Mg²⁺-L29E肌红蛋白复合物可作为人工核酸酶，触发线粒体凋亡途径，为基于蛋白质的抗癌策略提供了理论基础。

引言

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤，也是全球女性因癌症死亡的第二大原因[1]。在其各类亚型中，三阴性乳腺癌因其缺乏有效治疗靶点，具有极高的侵袭性，临床预后较差[2]、[3]、[4]。因此，迫切需要探索基于创新机制的新治疗策略。

化学核酸酶和人工工程化核酸酶已成为实现精准基因组编辑和抗癌治疗的极具前景的选择[5]、[6]。从本质上讲，癌症是一种基因组疾病，致癌突变会赋予细胞持续增殖和基因组不稳定性等特征[7]。过去几十年来，治疗方法从手术和放疗发展到细胞毒性化疗，再到分子靶向药物和免疫疗法，这体现了治疗策略向基于疾病机制的方向发展[8]。因此，工程化核酸酶是这一发展趋势的自然延伸，为破坏癌细胞基因组提供了有效的策略。

金属蛋白和金属酶以金属离子作为辅因子，在电子传递、氧气运输和催化等多种生物过程中发挥着重要作用[9]、[10]、[11]。肌红蛋白是一种由153个氨基酸组成的小型金属蛋白，含有铁原卟啉作为辅因子，主要负责氧气的储存和运输。由于其易于进行遗传和结构改造，肌红蛋白成为通过蛋白质工程设计人工金属酶的理想载体[12]、[13]、[14]。例如，通过引入额外的组氨酸残基或改变远端配体，可以制造出具有亚硝酸盐还原酶[15]、[16]、过氧化物酶[17]、[18]以及卡宾转移酶活性[19]、[20]的肌红蛋白突变体。另一种策略是在血红素远端口袋或远离血红素中心的位置构建非血红素金属结合位点，通过设计3-His、3-His-1-Asp和2-His-1-Met等结构，以及Fe²⁺或Cu²⁺结合位点，赋予蛋白新的催化功能，如一氧化氮还原酶[21]、[22]、[23]，以及亚硝酸盐还原酶和超氧化物歧化酶活性[24]、[25]。

值得注意的是，肌红蛋白还可以被重新设计为具有DNA切割活性，从而成为一种人工核酸酶。在之前的研究中，我们构建了L29E肌红蛋白突变体，其在血红素远端口袋形成了1-His-1-Glu（His64/Glu29）金属结合结构[26]。镁离子与血红素中的铁结合后，会形成独特的异核Mg²⁺-H₂O-血红素结构，这一结构可通过Mg²⁺-L29E肌红蛋白复合物的X射线晶体结构得到证实。该结构与天然核酸酶中的同核Mg²⁺结构类似[27]。研究表明，L29E肌红蛋白在镁离子存在下能够高效地切割和降解DNA。分子对接分析进一步表明，该蛋白与DNA的相互作用涉及与DNA大沟和小沟的多重氢键结合（见图1A），这支持其通过水解作用实现DNA切割的机制。

此外，先前的研究也发现某些肿瘤细胞中存在一定水平的肌红蛋白表达，它可能影响细胞的增殖和生理功能[28]、[29]。在这些细胞中持续检测到肌红蛋白，说明它在细胞内环境中具有足够的稳定性。受到Mg²⁺-L29E肌红蛋白复合体DNA切割活性的启发，本研究中我们构建了L29E肌红蛋白的真核表达载体，并将其转染到三阴性乳腺癌细胞中，旨在研究过表达这种人工核酸酶对三阴性乳腺癌细胞生理功能的影响，从而为乳腺癌的治疗策略提供新的思路。

章节节选

细胞培养

人类乳腺癌细胞系MDAMB231是从中国上海的国家认证细胞库获得的。这些细胞在含10%胎牛血清的Dulbecco改良 Eagle培养基中培养，培养温度为37℃，培养环境为5%二氧化碳浓度的湿润环境（Thermo Scientific，型号BB150）。培养基每48–72小时更换一次，当细胞密度达到80–90%时则每周传代两次。那些过表达野生型肌红蛋白或L29E突变型的稳定转染细胞系被用于后续研究。

在MDAMB231细胞中过表达肌红蛋白

为探究肌红蛋白及其具有DNA切割活性的突变体的功能，我们建立了分别表达野生型肌红蛋白或L29E突变体的稳定MDAMB231细胞系。如图1B所示，肌红蛋白免疫印迹实验证实，这些同源细胞系中目标蛋白已成功过表达。在两种稳定细胞系中均检测到了表达水平显著升高的肌红蛋白免疫反应带，而野生型细胞系中则仅检测到微弱的信号。

讨论

本研究表明，L29E肌红蛋白在镁离子存在下能在三阴性乳腺癌细胞中发挥细胞内DNA切割功能。这一结果十分重要，因为野生型肌红蛋白并不具备核酸酶活性，这说明L29E突变使得异核的Mg²⁺-H₂O-血红素结构能够切割染色体中的DNA。图9展示了这一作用的潜在机制：在镁离子存在下，过表达的L29E肌红蛋白会切割DNA，进而导致线粒体外膜通透性增加，进而引发一系列细胞死亡反应。

结论

总之，本研究证明了工程化的L29E肌红蛋白可在三阴性乳腺癌细胞的细胞内环境中作为依赖镁离子的人工核酸酶发挥作用。我们的研究结果表明，过表达L29E肌红蛋白会造成严重的DNA损伤，进而引发线粒体功能障碍、G1期细胞周期停滞，以及MDAMB231细胞内在凋亡途径的激活。这些发现为开发基于蛋白质的人工核酸酶奠定了基础。

CRediT作者贡献说明

Zi-Lei He：负责初稿撰写、方法设计以及数据整理工作。Li-Juan Sun：负责实验验证、研究实施以及数据整理工作。Shu-Qin Gao：负责初稿撰写、研究实施以及数据整理工作。Ying-Wu Lin：负责文章审阅与编辑、项目监督、项目管理以及研究概念设计工作。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本项目得到了中国湖南省教育厅科研基金（编号：23B0400）以及国家自然科学基金（编号：32171270）的支持。