各向异性多孔水凝胶纤维涂层改性钛可调节免疫微环境，从而促进内源性骨再生

《Biomaterials》：Anisotropic Porous Hydrogel Fiber Coating Modified Titanium Modulates the Immune Microenvironment to Enhance Endogenous Bone Regeneration

　　

Huilin Zhao|Jingxi Wang|Zengzilu Xia|Liu He|Huiwen Zhang|Hongli Luo|Chuanrong Zhao|Kaiyong Cai

中国重庆400044，重庆大学生物工程学院，教育部生物流变学科学重点实验室

摘要

钛植入物由于其固有的生物惰性而存在局限性，这会影响骨整合及长期稳定性。在此，我们设计了一种具有免疫调节功能且结构各向异性的钛界面，旨在促进骨生成的同时调节骨免疫微环境。该涂层由纳米羟基磷灰石、甲基丙烯酸明胶和丝素蛋白组成，通过电纺丝和多模式交联技术制备，从而形成有序的拓扑结构。这种各向异性结构能够通过机械敏感反应引导骨髓间充质细胞的排列与迁移，同时通过抑制M1型巨噬细胞极化并促进M2型转化来调节局部免疫环境。研究结果表明，该涂层可通过降低巨噬细胞中的炎症和氧化应激来发挥免疫调节作用，同时还能直接支持骨髓间充质细胞的成骨信号传导和基质矿化。在体内实验中，经过改性的植入物减少了早期纤维包膜形成，促进了植入物周围的骨形成，为骨整合创造了有利的骨免疫微环境。这些发现表明，将拓扑各向异性与生物活性水凝胶化学结合，是一种提升钛植入物生物性能并促进骨整合的有效策略。

引言

因创伤或疾病导致的大面积骨缺损修复仍是临床上的重大挑战。钛植入物因其机械强度、耐腐蚀性和生物相容性而被广泛用于骨科和牙科领域[1]。然而，其生物惰性表面往往会导致骨整合不良、无菌性松动以及二次手术风险增加[2]、[3]。成功的骨整合不仅需要生物活性表面，还需要恰当调控的早期免疫反应[4]、[5]。植入后，吸附在表面的蛋白质会引发血块形成，并招募炎症细胞和前体细胞。但过度的炎症则可能导致纤维包膜形成，进而妨碍骨整合[6]。包括巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和T细胞在内的多种免疫细胞会与间充质细胞相互作用，共同塑造骨免疫微环境。其中，巨噬细胞起着核心作用：M1型巨噬细胞会分泌IL-6、IL-1β和TNF-α，从而加剧炎症；而M2型巨噬细胞则会释放TGF-β、IL-10和BMP-2，以促进组织修复和骨形成。早期的促炎性巨噬细胞反应对于清除碎片和激活免疫系统是必要的，但过度或持续的炎症则可能导致纤维包膜形成[7]。因此，实现从M1型到M2型的及时转变对于植入物的有效整合至关重要[8]。那些既能增强表面生物活性又能调节免疫反应的策略，对于骨再生而言极为重要。

表面拓扑结构和生化成分会显著影响巨噬细胞极化、免疫细胞募集以及成骨信号传导[9]、[10]。天然骨骼具有由羟基磷灰石矿化的有序胶原纤维构成的结构，这种结构能为成骨细胞功能和免疫稳态提供支撑[11]、[12]。因此，那些能够再现这种有序结构的仿生各向异性涂层，相比无序结构，更有利于促进骨整合。水凝胶能够提供湿润且可调控的微环境，可作为多功能涂层，有助于促进细胞在钛表面的早期浸润[7]、[13]、[14]。不过，单纯的水凝胶难以形成稳定且有序的微纤维或纳米纤维[15]。此外，仅依靠物理改性往往会导致涂层粘附力弱且容易脱落[16]。在各种改性方法中，聚多巴胺因其强大的粘附性能和多样的化学反应性而被广泛用于钛表面改性[17]、[18]。通过聚多巴胺进行表面工程处理，可以固定生物活性离子或生物分子，进而调节巨噬细胞反应，从而促进骨整合。Wang等人报道了一种通过聚多巴胺螯合作用制备的Mn²⁺修饰钛表面，该表面具有更好的抗氧化能力，且能促进具有免疫调节作用的骨整合[19]。Zhu等人则通过多巴胺辅助功能化技术在微孔钛表面构建了仿生矿化胶原界面，从而提升了其成骨诱导能力和骨整合效果[20]。尽管取得了这些进展，大多数基于聚多巴胺的改性策略主要集中在生化表面功能化上，而植入物界面的微观结构则相对简单。电纺丝技术则为制造类似细胞外基质层状结构的纳米纤维架构提供了一种有效方法[21]、[22]。例如，电纺丝纳米纤维膜已被用于创建仿生微环境，以引导骨再生[23]。此外，经聚多巴胺改性的GelMA水凝胶纳米纤维也被用作神经引导导管，能够输送生物活性分子，促进血管生成和轴突再生[24]。这些研究都体现了电纺丝纤维在模拟细胞外基质结构方面的优势。然而，目前大多数电纺丝系统都是作为独立的支架或膜使用，而非与植入物表面整合的功能性涂层。丝素蛋白和甲基丙烯酸明胶等天然聚合物具有优异的生物相容性和可降解性[25]、[26]、[27]，而纳米羟基磷灰石则能促进成骨细胞的分化和矿化[28]、[29]。GelMA是一种可光交联的、类似细胞外基质的水凝胶基质，能够支持细胞粘附和信号传导。不过，单独的GelMA在制成电纺丝纤维时缺乏足够的结构稳定性[30]。相比之下，丝素蛋白含有丰富的β折叠结构，这类结构能够提升材料的机械强度和结构耐久性[31]。将GelMA与丝素蛋白相结合，就可以在保持生物活性水凝胶功能的同时，增强材料的结构强度。再加入纳米羟基磷灰石，就可以重现天然骨骼中的无机矿物相，从而形成类似矿化胶原的有机-无机复合界面。

在本研究中，纯钛被用作对照材料，用以评估这种集成表面改性策略的生物学效应。对于经过涂层的样品，首先对钛材进行碱热处理，使其表面形成微/纳米级粗糙结构，随后再进行聚多巴胺改性处理和电纺丝操作。这种预处理方式提高了表面粗糙度以及界面反应性，有助于细胞附着，同时为聚多巴胺的沉积以及后续涂层的粘附提供支撑点。在经过粗糙处理和聚多巴胺改性的钛界面基础上，进一步制备出了各向异性的GelMA/SF/nHAPs水凝胶纤维涂层，该涂层模仿了天然骨骼细胞外基质的诸多特征，包括类似有机基质的环境、与矿物质相关的信号以及有序的纤维拓扑结构。在电纺丝过程中，通过高速旋转滚筒收集纤维，从而形成了类似矿化胶原有序结构的各向异性纤维架构。最后，通过光交联和乙醇处理来稳定水凝胶网络。

我们推测，生物活性水凝胶化学与各向异性纤维拓扑结构的结合，能够调节巨噬细胞反应并支持成骨活性，从而为植入物的整合创造有利的骨免疫微环境。我们在体外和体内环境中，系统地评估了这些涂层的免疫调节和成骨功能。体外实验通过巨噬细胞和骨髓间充质细胞检测，来评估细胞对涂层的特异性反应；而体内的炎症和成骨结果，则进一步帮助我们解读整体骨免疫效应。碱处理形成的纳米级拓扑结构提升了涂层的粘附性，而聚多巴胺层则提供了反应性锚定位点以及抗氧化作用，这些都有助于促进M2型巨噬细胞极化。与此同时，有序的纤维结构还引导了细胞的迁移和排列。通过这种协同的拓扑结构和生化策略，该涂层有望在不依赖外源生长因子的情况下，调节早期炎症反应，改善局部微环境，从而促进骨再生。

章节节选

材料与试剂

钛箔和钛棒购自中国宝鸡的宏信源公司。A型明胶（源自猪皮）和脂多糖购自美国密苏里州的Sigma Chemical公司。蚕茧购自中国安康市。纳米羟基磷灰石、溴化锂、六氟异丙醇、无水碳酸钠和甲基丙烯酸酐购自中国上海的阿拉丁实业有限公司。Thermo Fisher Scientific公司提供了FITC抗小鼠CD86抗体和APC抗体

GelMA/SF/nHAPs复合涂层的表征

图1A、B展示了电纺丝水凝胶纤维改性钛基底的设计理念和制备工艺。明胶链上大量的氨基和羧基可作为甲基化反应及后续化学改性的反应位点。通过¹H NMR光谱验证了GelMA的成功合成（见图1C）。在5.34-5.63 ppm处出现的两个特征双质子信号，对应于甲基丙烯酸乙烯基的顺式和反式构型

结论

本研究通过电纺丝和多模式交联技术，在经多巴胺改性的钛植入物表面成功制备出了各向异性的水凝胶纤维涂层。这种有序的纤维结构能够提供定向的拓扑信号，引导骨髓间充质细胞沿纤维轴线延伸和迁移。此外，该涂层还能通过降低活性氧水平、抑制M1型巨噬细胞极化等方式，调节局部免疫微环境

CRediT作者贡献说明

Hongli Luo：可视化分析。Huiwen Zhang：实验研究、定量分析。Kaiyong Cai：论文撰写与修改、研究指导、资金获取、概念构思。Chuanrong Zhao：论文撰写与修改、研究指导。Jingxi Wang：可视化分析、实验研究。Liu He：实验研究。Zengzilu Xia：论文撰写与修改、研究指导、资金获取、概念构思。Huilin Zhao：论文初稿撰写、可视化分析、方法设计、实验研究、数据整理

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。

数据可用性

本研究的相关数据，可在合理请求下从相应作者处获取。

利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

作者衷心感谢重庆大学的分析测试中心在材料表征方面给予的帮助。本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：NSFC，项目编号52333011）、国家自然科学基金的联合资助（项目编号U24A20763）、中国国家重点研发计划（项目编号2022YFB3804400和2024YFC2418600），以及重庆市自然科学基金（项目编号cstc2021jcyj-cxttX0002）的支持。