《Bioorganic Chemistry》：Precision imaging of Pantetheinase activity in a collagen-induced arthritis model via a Ratiometric fluorescent probe
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Dongjin Wu|Jie Zhao|Zhaoqiang Xu|Yu Zhang|Shuai Peng|Lei Zhang|Xuyu Song|Yuxing Lin中国山东省济南市北园街247号，山东大学第二附属医院医学科学研究所，齐鲁医学院，邮编250033摘要类风湿性关节炎
Dongjin Wu|Jie Zhao|Zhaoqiang Xu|Yu Zhang|Shuai Peng|Lei Zhang|Xuyu Song|Yuxing Lin
中国山东省济南市北园街247号，山东大学第二附属医院医学科学研究所，齐鲁医学院，邮编250033
摘要
类风湿性关节炎是一种致残性高且易复发的慢性自身免疫性疾病，其特征为滑膜炎、肉芽组织形成以及渐进性骨侵蚀，这些都会导致关节损伤和功能丧失。尽管荧光成像已成为观察类风湿性关节炎病理变化的重要工具，但由于操作简单，大多数荧光探针仍以卡拉胶诱导的足部水肿模型作为研究基础。而胶原诱导的关节炎模型则因能引发针对软骨的免疫反应，且该反应与人类类风湿性关节炎的病理过程高度相似，因此被视作临床前研究的金标准。泛硫醇酶是参与维生素B5循环及炎症调节的关键酶，可能成为评估关节炎的潜在生物标志物，但目前其在胶原诱导的关节炎模型中的作用尚未得到充分研究。在本研究中，我们设计了一种具有较大斯托克斯位移、良好灵敏度和高选择性的比率型荧光探针，用于检测泛硫醇酶活性。共聚焦成像实验表明，该探针的荧光强度能够准确反映小鼠原代软骨细胞中的泛硫醇酶活性。此外，该探针还能实现对胶原诱导的关节炎模型中发炎踝关节的体内荧光成像，显示出酶活性的升高。组织学和免疫组化分析进一步证实，泛硫醇酶的高表达与软骨破坏及滑膜炎症存在关联。因此，TMN-Pan这一化学探针为揭示泛硫醇酶在类风湿性关节炎中的病理作用提供了有力工具。
引言
类风湿性关节炎是一种致残性高且易复发的慢性自身免疫性疾病，其典型特征为滑膜炎、肉芽组织形成以及渐进性骨侵蚀，往往会导致不可逆的关节损伤和功能丧失[1]、[2]。目前使用的糖皮质激素和非甾体抗炎药虽可控制炎症，但往往无法阻止软骨损伤[3]、[4]。有研究表明，即便炎症得到控制，关节功能仍可能继续下降[5]、[6]。由于软骨细胞是维持软骨基质功能的唯一细胞类型，其在类风湿性关节炎中的作用至关重要。因此，开发用于监测与关节病变相关的炎症介质的诊断工具，对于改善患者的长期预后具有重要意义。
为便于诊断类风湿性关节炎，人们已开发出多种荧光探针，用于检测活性氧等生物标志物及相关酶类[7]。不过，目前用于此类诊断的小分子荧光探针大多基于卡拉胶诱导的足部水肿模型，这也是因为该模型的诱导流程较为简单[8]。然而，该模型主要涉及急性中性粒细胞浸润，与人类类风湿性关节炎复杂的免疫反应存在差异，这限制了这类探针在临床应用中的可靠性。相比之下，胶原诱导的关节炎模型能引发针对软骨的免疫反应，其病理过程与人类类风湿性关节炎极为相似[9]、[10]、[11]。尽管胶原诱导的关节炎模型具有诸多优势，但仍有少数研究利用荧光探针来检测该模型中的酶活性。
泛硫醇酶（主要是由VNN1基因编码的Vanin-1亚型）可将泛硫醇分解为泛酸和半胱胺。这一反应的生理意义并不仅限于底物的分解，它所产生的两种生物活性物质还能触发不同的下游信号通路[12]。泛酸是辅酶A的前体，而辅酶A则是三羧酸循环和脂肪酸氧化过程中不可或缺的辅助因子，因此Vanin-1的活性能够调控有氧呼吸和脂质代谢。在炎症反应中，这种酶促反应是内源性半胱胺的唯一生理来源[13]。半胱胺在细胞膜上生成后会迅速被氧化为胱胺，而胱胺则会抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性，进而降低细胞内的谷胱甘肽水平。因此，Vanin-1的过度表达会耗尽谷胱甘肽储备，削弱细胞的抗氧化防御能力，同时增加活性氧的生成量[14]。这种氧化应激又会进一步引发炎症级联反应[15]。迄今为止，虽然已有多种针对泛硫醇酶设计的荧光探针[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]（详见表S1），这些探针已被应用于药物性肝损伤[16]、肠道黏膜炎[25]和肾损伤[17]等多种急性炎症模型中，但这类急性模型往往无法模拟自身免疫性疾病中的全身性炎症环境[29]。与主要反映短暂血管通透性和水肿的卡拉胶诱导的足部水肿模型不同，胶原诱导的关节炎模型能为研究Vanin-1在慢性自身免疫反应中的作用提供更全面的平台。
在本研究中，我们报道了一种比率型荧光探针TMN-Pan，并成功将其应用于胶原诱导的关节炎模型中检测泛硫醇酶活性，该模型是类风湿性关节炎研究的金标准炎症模型。该探针由异佛尔酮丙二腈荧光团（TMN-NH?）与泛酸识别单元通过一种可自降解的对氨基苯甲醇连接子结合而成。泛硫醇酶会特异性地切断泛酸与该对氨基苯甲醇连接子之间的酰胺键，进而引发对氨基苯甲醇的1,6-消除反应，从而使荧光团释放出来。释放出的游离氨基能够恢复分子内的电荷转移效应，进而显著增强荧光强度，并使荧光发射波长向红色偏移。TMN-Pan表现出极高的灵敏度和选择性。与现有的许多优秀探针相比，TMN-Pan具备多项优势，使其在复杂的生物环境中也能保持良好的检测性能。首先，与大多数依赖单通道“开启”响应的现有探针不同，TMN-Pan具有比率型响应特性，这种特性可通过内部校准有效消除探针浓度变化和激发强度波动带来的干扰，从而更准确地量化酶的活性。其次，TMN-Pan具有较大的斯托克斯位移，这一优点优于目前已报道的基于花青素或萘结构的探针（详见表S1）。较大的斯托克斯位移对于实现高精度成像非常重要，因为它能够减少激发光与发射光之间的光谱串扰，同时降低背景自发荧光的干扰。此外，TMN-Pan也是首个用于在胶原诱导的关节炎模型中检测泛硫醇酶活性的荧光探针。该探针成功实现了对发炎踝关节的荧光成像，与对照组相比，其荧光信号明显增强。进一步的免疫组化分析也证实，胶原诱导的关节炎模型小鼠的软骨组织中Vanin-1的表达水平确实升高，这进一步证明了TMN-Pan在类风湿性关节炎研究中的可靠性。
内容节选
TMN-Pan的合成
TMN-Pan的合成步骤如补充信息中的方案S1所示，仅需几个步骤即可完成。具体的合成细节和结构表征信息也在补充信息中给出。
光谱检测仪器与操作流程
除非另有说明，所有光学测量均在10 mM磷酸盐缓冲液（pH值为7.4）中进行。TMN-Pan的储备溶液浓度为10 mM，先在DMSO中配制，然后再用缓冲液稀释至所需的工作浓度。紫外-可见吸收光谱是通过特定仪器获取的
设计与合成
荧光团TMN-NH?具有典型的供体-π-受体结构，这类结构具有很强的分子内电荷转移效应。为了构建特定的探针TMN-Pan，我们通过碳酰胺键将TMN-NH?的供电子氨基与经过修饰的泛酸对氨基苯甲醇连接子结合在一起。碳酰胺基团具有吸电子性质，能够有效抑制分子内电荷转移过程，从而减弱荧光强度。当酶催化该连接子断裂后
结论
综上所述，我们成功开发了一种新型的比率型荧光探针TMN-Pan，可用于检测泛硫醇酶的活性。该探针通过一种可自降解的对氨基苯甲醇连接子，将泛酸识别单元与基于异佛尔酮的荧光团连接在一起。在酶的催化作用下，TMN-Pan会切断泛酸与连接子之间的键，并引发一系列消除反应，最终释放出游离氨基，从而使荧光强度上升且发射波长向红色偏移。该探针具有较大的斯托克斯位移，
CRediT作者贡献说明
Dongjin Wu：指导工作、实验开展、资金筹集、数据整理。Jie Zhao：实验开展、数据整理、概念构思。Zhaoqiang Xu：初稿撰写、方法设计、实验开展、数据分析、数据整理。Yu Zhang：实验开展。Shuai Peng：实验开展。Lei Zhang：方法设计。Xuyu Song：实验开展、资金筹集。Yuxing Lin：文章审阅与编辑、初稿撰写、项目管理、方法设计、实验开展、资金筹集，
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
作者衷心感谢山东大学的李明勇教授和马超老师在整个研究过程中的指导与帮助。本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：22007056）、山东省自然科学基金（编号：ZR2025MS1525、ZR2025LMB031和ZR2020QB152）以及山东大学第二附属医院科研培育基金（编号：2023JX22）的支持。
