探究二甲双胍对α-葡萄糖苷酶的竞争性抑制机制

《Bioorganic Chemistry》：Exploring the competitive inhibition mechanism of α-glucosidase by metformin

　　

Miaomiao Tian|Chengrui Xiao|Yanan Wei|Yixuan Li|Siyu Li|Siying Li|Hui Guo|Xun Tuo|Baozhu Chi

中国江西省南昌市南昌大学化学与化工学院，邮编330031

摘要

二甲双胍（MET）是经美国食品药品监督管理局批准用于治疗2型糖尿病（T2DM）的常用一线药物。α-葡萄糖苷酶被认为是治疗T2DM的有效靶点之一。然而，MET与α-葡萄糖苷酶之间的潜在相互作用机制尚不清楚。因此，本研究全面探讨了MET对α-葡萄糖苷酶的影响，包括结合机制、构象变化以及结构与功能的关系。酶活性测定表明，MET对α-葡萄糖苷酶具有竞争性抑制作用。荧光光谱和电化学实验显示，MET与α-葡萄糖苷酶通过疏水相互作用自发形成稳定复合物。该复合物会阻碍[Fe(CN)₆]^3?/4?的扩散，降低其扩散系数。CD、AFM和R_g分析表明，该复合物的二级结构比单独的α-葡萄糖苷酶更不稳定，这种不稳定性可能导致酶活性受到抑制。计算机模拟显示，MET能与α-葡萄糖苷酶的催化三联体残基（Asp214、Glu276和Asp349）形成稳定的氢键。其中，Asp214的氢键形成概率和持续时间最高。这种与催化亲核剂的相互作用很可能是MET竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的原因。在100纳秒内的分子动力学快照显示，MET在分子层面与α-葡萄糖苷酶形成了稳定复合物。总体而言，这些研究结果揭示了MET抑制α-葡萄糖苷酶的另一种分子机制，为证明其在治疗T2DM中的降糖效果提供了依据。

引言

糖尿病是一种常见且严重的代谢性疾病，近几十年来其患病率持续上升[1]。国际糖尿病联合会预计，到2045年，将有近7亿人患有糖尿病[2]。糖尿病可引发多种并发症，包括大血管疾病、视网膜病变、神经病变、肾病以及心血管疾病[3]。2型糖尿病占所有糖尿病病例的90%以上，其特征是外周组织存在胰岛素抵抗，同时由于胰腺β细胞功能逐渐衰退而出现相对胰岛素缺乏[4]。2型糖尿病的主要临床表现为高血糖，这会引发心血管疾病、肾病和神经病变等多种并发症[5]、[6]。因此，控制血糖水平对于治疗2型糖尿病至关重要[7]。α-葡萄糖苷酶是一种重要的膜结合肠道酶，负责水解膳食碳水化合物中的末端α-1,4-糖苷键，从而生成可被吸收的葡萄糖[8]。由于在碳水化合物消化的最终步骤中起着关键作用，它直接调控餐后血糖水平[9]。因此，抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以减缓葡萄糖的吸收，使其成为治疗2型糖尿病的重要靶点[10]。

目前，临床指南推荐将二甲双胍作为2型糖尿病患者的一线药物治疗药物[11]。这得益于它相较于其他降糖药物更为良好的安全性以及已得到验证的疗效[12]。二甲双胍是一种多靶点药物，能够与多种生物系统发生相互作用[13]。它通过多种机制降低血糖，主要包括抑制肝脏糖异生、减少肠道葡萄糖吸收以及增加外周组织对葡萄糖的摄取。此外，二甲双胍还能在多种组织中激活AMPK，进而发挥其代谢调节作用[14]。有研究表明，巴西咖啡豆与二甲双胍共同使用可强烈抑制α-葡萄糖苷酶的活性，这说明二甲双胍可能直接与该酶发生相互作用[15]。二甲双胍的降糖效果主要归因于AMPK的激活、肝脏糖异生的抑制以及肠道葡萄糖代谢的调节。不过，仍需进一步研究以确定二甲双胍是否还可能通过直接抑制肠道α-葡萄糖苷酶这一机制发挥作用。

本研究系统地研究了二甲双胍对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以及二者之间的相互作用机制和相关的构象变化。研究采用了多光谱分析、电化学分析、原子力显微镜检测以及计算机模拟等多种方法相结合的综合研究策略。阐明α-葡萄糖苷酶与二甲双胍的结合机制，对于进一步了解二甲双胍在糖尿病管理中的临床应用价值具有重要意义。此外，这项研究还为开发新的2型糖尿病治疗方法奠定了基础。

章节节选

材料与试剂

二甲双胍购自中国上海的Macklin Biochemical Co., Ltd.，而来自酿酒酵母的α-葡萄糖苷酶（S10050，活性≥50?U/mg）以及对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG，编号3767-28-0）则购自中国上海的Yuanye Biotechnology Co., Ltd.。这种α-葡萄糖苷酶被广泛用于研究药物与酶的相互作用，以及探索糖尿病的潜在治疗药物[16]、[17]。二甲双胍溶解在超纯水中，而α-葡萄糖苷酶和对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷则经过相应处理

酶活性测定

为了研究二甲双胍对α-葡萄糖苷酶功能的直接影响，进行了酶活性测定[19]。如图1?A所示，二甲双胍以浓度依赖的方式抑制α-葡萄糖苷酶的活性。随着二甲双胍浓度的升高（0.5?μM、1?μM和5?μM），酶活性分别降至初始水平的82.3%、76.5%和67.0%。这些结果表明，二甲双胍确实能有效地抑制α-葡萄糖苷酶的活性。在1?nM浓度下，阿卡波糖的抑制率为16.8%

结论

本研究通过多种互补的方法研究了二甲双胍与α-葡萄糖苷酶之间的相互作用。通过电化学分析、荧光光谱、原子力显微镜检测以及计算机模拟，系统评估了这种结合对α-葡萄糖苷酶结构和功能的影响。酶活性测定证实，二甲双胍通过直接与α-葡萄糖苷酶的活性位点结合，对其产生竞争性抑制作用。电化学实验表明，二甲双胍会形成一种无电活性的

CRediT作者贡献说明

Miaomiao Tian：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，资源获取，方法设计，正式分析，数据整理。Chengrui Xiao：撰写——审阅与编辑，验证工作，软件使用。Yanan Wei：撰写——审阅与编辑，验证工作，软件使用。Yixuan Li：验证工作。Siyu Li：数据整理。Siying Li：撰写——审阅与编辑。Xun Tuo：撰写——审阅与编辑，验证工作，资源获取。Baozhu Chi：项目监督，项目管理，资金筹集。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

江西省自然科学基金（编号20242BAB25202）。国家自然科学基金（编号22064012）。