基于固态纳米孔传感器的透明质酸及其重链修饰分析评估

《Annual Review of Analytical Chemistry》：Analytical Assessment of Hyaluronan and Its Heavy Chain Modification with Solid-State Nanopore Sensors

　　

透明质酸（hyaluronan, HA）是一种在自然界中广泛存在的必需多糖，在多种基础生物学过程和疾病中发挥多样化的生物学作用。HA的一个关键特征是其分子量（molecular weight, MW），其范围从几个双糖到数十万道尔顿的聚合物。由于HA的行为明显依赖于其大小，因此准确测定不同条件下HA的MW分布具有重要研究意义。固态纳米孔（solid-state nanopore, SSNP）平台为此提供了解决方案，即HA分子在通过人工制备的孔道时以单个分子的形式进行电学探测。该方法通过工艺优化及与特异性HA提取方案的联用，已被构建为一种灵敏且定量的HA MW评估工具。这些进展使其能够应用于多个重要的生物学问题，包括重链修饰HA的新兴作用。

**基于固态纳米孔传感技术的透明质酸及其重链修饰分析评估**

透明质酸（hyaluronan, HA）是一种线性非硫酸化糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG），由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺重复双糖单元组成，存在于从寡糖到约10 MDa的宽泛链长范围内，在大多数脊椎动物中平均介于1–8 MDa。HA在组织结构与水合维持、信号传导、白细胞黏附、发育、细胞增殖、微生物毒力及炎症等多种生物学过程中发挥重要作用。HA的分子量（molecular weight, MW）是其生物学活性的关键决定因素：高分子量HA（high-MW HA, HMW-HA）通常具有抗炎、抗血管生成及保护细胞配体和表面受体的功能；而低分子量HA（low-MW HA, LMW-HA）则可通过竞争性结合蛋白相互作用改变受体聚集和信号传导，降低细胞外基质（extracellular matrix, ECM）完整性，并与癌症等疾病中的肿瘤发生和转移相关。因此，准确测定生理条件下HA的MW分布对于理解正常与病理生物学过程至关重要。然而，现有分析技术存在显著局限：常规质谱虽具有优异的尺寸灵敏度，但通常限于低MW寡糖分析；多角度激光光散射（multi-angle laser light scattering, MALLS）与高效液相色谱及尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）联用可确定HA尺寸分布，但需要较大样品量且流程繁琐；凝胶电泳虽可提供类似核酸分析的HA定径，但同样需要中等至高样品量并涉及多个耗时步骤。鉴于此，研究人员致力于开发一种快速、定量且高灵敏度的HA MW分析技术，以探测HA仅呈低浓度的生理标本，固态纳米孔（solid-state nanopore, SSNP）技术应运而生。

**研究背景与核心问题**

SSNP技术基于电阻脉冲传感（resistive pulse sensing, RPS），即库尔特效应（Coulter effect），通过测量实体对孔道的体积阻塞来推断其尺寸特征。该技术由Wallace Coulter于二十世纪中叶创立，现已广泛应用于临床血细胞评估。将其转化至分子尺度始于2001年Li等人报道的人工蛋白质纳米孔传感模拟系统。此后，SSNP被用于探测DNA、RNA、蛋白质、核蛋白复合物等多种生物分子的多元特征。SSNP平台的核心是硅芯片，其支撑一层约10–20 nm厚的低应力氮化硅绝缘薄膜窗口，窗口内制备有单个纳米级孔道，可通过透射电子显微镜烧蚀、离子铣削或可控介电击穿等技术制备。芯片置于简易流通池中，两侧分别引入电解液缓冲液后，施加约100 mV的 modest 电压即可建立强而高度局域化的电场，驱动带电分子从膜一侧电转位至另一侧，产生可被检测的离子电流瞬态降低信号。每个转位事件（translocation event）的特征参数包括：事件幅度（ΔI，对应分子直径）、持续时间（Δt，对应轮廓长度）以及事件电荷亏损（event charge deficit, ECD，即事件形状所定义的面积）。

**研究开展与核心结论**

HA的SSNP分析于2018年首次实现。与其他GAGs不同，HA具有均一且一致的负电荷，确保了平稳可重复的转位动力学。早期测量显示HA聚合物向正电极方向转位并产生清晰事件信号。由于HA是低持续长度（约5 nm）的长聚合物，倾向于以折叠的熵驱动构象转位，导致幅度和持续时间参数扰动。研究人员发现这两个参数呈反相关关系：折叠分子占据更多孔道横截面积（幅度更高）但完全转位更快（持续时间更短）。因此，ECD被确定为更合适的度量指标，因其同时考虑了幅度和持续时间。此外，SSNP事件速率与施加电压呈线性关系，表明分子捕获不存在尺寸偏倚，使得混合物中代表性HA聚合物的MW分布测量能够反映总体分布。

为将信号转换为MW，研究人员采用了一系列经SEC-MALLS确证的准单分散HA标准品进行校准测量。独立SSNP分析在ECD空间产生明确群体，其中心值与已知MW的对数呈幂律关系。为进一步提高测量精度，研究人员开发了HA迷你阶梯策略：将三种MW widely separated 的准单分散HA混合，在每个设备测量前进行快速内部校准，可在五分钟内完成。

**关键技术与优化方法**

研究人员系统研究了影响SSNP信号的实验条件，包括缓冲液离子强度、施加电压和孔径大小。以LiCl为电解质（因其极高水溶性和Li?小尺寸可有效屏蔽带电分子），浓度从2 M增至8 M时，事件幅度线性增加，持续时间和ECD呈指数增加，同时事件速率因电荷屏蔽导致的电泳驱动力降低而显著下降。综合考虑事件分辨率与灵敏度需求，6 M LiCl被确定为最优盐浓度。电压依赖性研究表明，尽管较高电压可提高信噪比（signal-to-noise ratio, SNR），但ECD值在各MW间保持一致，表明幅度增加与持续时间减少相互抵消；事件速率随电压增加而提高，但高电压加剧设备污染。最优电压确定为200–300 mV，低浓度样品可酌情提高电压以牺牲测量稳定性为代价换取灵敏度。孔径研究表明，ECD随孔径增大而降低，测量分辨率随之下降；小孔径虽具优势但更易污染堵塞，最优孔径确定为约7 nm。

在最优条件下，SSNP分析展现出卓越灵敏度：仅需约10 ng总HA，在约10分钟内测量数百至数千个分子即可获得完整尺寸分布。然而该技术存在重要局限：低于约50 kDa的HA分子无法被检测；且平台存在非零背景事件率（约0.01–0.05 s?1），要求HA分析时事件速率显著高于背景以确保信号可靠性。

**HA特异性提取技术**

由于SSNP缺乏内在选择性，复杂生物样本中特定靶分子的分析需依赖特异性提取技术。研究人员开发了基于Versican G1结构域（VG1）的亲和纯化方法：利用装饰有VG1的超顺磁珠特异性识别HA，通过磁分离和后续洗脱实现HA分离。为克服早期热变性或蛋白酶降解洗脱导致的珠子单次使用局限，研究人员开发了高盐浓度洗脱策略——高浓度LiCl可通过电荷屏蔽效应破坏VG1与HA的结合，且洗脱条件与SSNP分析需求匹配无需进一步纯化；VG1活性可在低盐缓冲液冲洗后恢复，实现珠子的迭代重复使用。实验表明VG1稳定性是限制重复使用次数的主要因素。

**应用拓展：重链修饰HA研究**

炎症相关蛋白TSG-6可催化IαI家族蛋白聚糖的重链（heavy chain, HC）与HA共价结合形成HC•HA复合物，这是HA唯一的已知共价修饰。研究人员将SSNP技术拓展至HC•HA分析，开发了双步亲和提取流程：首先利用抗HC抗体珠捕获HC•HA及其他含HC实体，随后用蛋白酶消化释放所有HC和抗体结合的HA及硫酸软骨素（chondroitin sulfate, CS），再以VG1珠特异性提取HA，最终高盐洗脱进行SSNP分析。该流程排除了有非偶联HA和IαI、前α抑制剂（prealpha inhibitor, PαI）等其他含HC实体的干扰，实现了高纯度HC•HA提取。

应用该技术，研究人员比较了实验诱导滑膜炎马与健康对照关节滑液中HA和HC•HA的MW分布。结果显示，滑膜炎关节中总HA和HC•HA的中位MW均显著低于健康对照，且两者呈现相似的尺寸减小趋势，提示HC偶联过程可能缺乏对HA MW的依赖性偏好。SSNP技术首次实现了HC•HA尺寸分布的测定，为该新兴研究领域奠定了基础。

**研究意义与展望**

该研究发表于《Annual Review of Analytical Chemistry》，系统阐述了SSNP技术在HA分析中的发展、优化及应用拓展。该技术为理解HA在正常和病理过程中的作用提供了独特工具，其灵敏度、快速性和定量特性使其在低HA含量样本分析中具有不可替代的优势。未来发展方向包括：通过小孔径或表面改性提高分辨率以检测更低MW的HA片段；改善测量以分析更低总HA含量的标本；优化提取方案以提高产率和通量；以及向临床转化，将HA MW分布与含量结合作为炎症相关疾病（如肝纤维化、肺癌、膀胱癌）的生物标志物。此外，SSNP HA分析原理有望扩展至硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素等其他重要GAGs，尽管变异性硫酸化对转位动力学的影响仍需解决。HA尤其适合SSNP分析，因其测量高度稳定且不易发生强表面相互作用导致的不可逆堵塞，加之可控介电击穿等高通量、低成本制备方法的发展前景，以及内部校准策略对设备间变异的有效控制，使该技术在生物分析领域具有广阔前景。