编辑推荐：
球状蛋白通常被预期采取具有固定二级结构（α螺旋和β折叠）的折叠构象。折叠切换蛋白（fold-switching proteins，亦称metamorphic proteins）通过响应细胞刺激而重塑其二级和/或三级结构，挑战了这一传统认知。尽管这类构象可变蛋白
球状蛋白通常被预期采取具有固定二级结构（α螺旋和β折叠）的折叠构象。折叠切换蛋白（fold-switching proteins，亦称metamorphic proteins）通过响应细胞刺激而重塑其二级和/或三级结构，挑战了这一传统认知。尽管这类构象可变蛋白曾被认为是有害的进化副产物且缺乏内在生物学意义，近期研究表明进化已正向选择了其双重折叠行为，该特性在所有生物界的生物学过程中发挥关键作用。折叠切换现象研究范围的扩大促使学界重新审视其对传统观念的颠覆，并提出了关于蛋白质结构、生物物理学及进化的根本性未解问题。本文中研究人员讨论了当前为解答这些问题所取得的进展，并对该领域的未来方向提出建议。
关键词：fold-switching proteins（折叠切换蛋白）；metamorphic proteins（ metamorph 蛋白/可转换折叠蛋白）；protein folding（蛋白质折叠）；protein structure prediction（蛋白质结构预测）；protein design（蛋白质设计）；protein evolution（蛋白质进化）。
《Fold-Switching Proteins（折叠切换蛋白）》论文解读
研究背景与意义
传统蛋白质结构生物学长期遵循"一级序列决定唯一天然构象（one sequence–one fold）"的Anfinsen法则，认为球状蛋白折叠为单一、稳定的三级结构以行使其功能。然而折叠切换蛋白（fold-switching proteins，又称metamorphic proteins）颠覆了这一范式——同一多肽链能在细胞刺激（配体结合、pH、温度、寡聚化等）下发生二级和三级结构的实质性重排（如α螺旋?β折叠互换），呈现两种或以上稳定、具功能意义的折叠态。此类蛋白早期被视为罕见进化过渡态，近年实验证实近100种已获表征，估计PDB中可达4%，大肠杆菌中可达5%，且在转录调控（RfaH）、免疫应答（XCL1）、生物钟（KaiB）等进程中具重要生理功能。由于AlphaFold等主流模型难以预测多重折叠态，折叠切换现象对蛋白质折叠理论、同源蛋白结构保守性假说及结构预测算法提出根本挑战。该综述发表于《Annual Review of Biophysics》，系统梳理折叠切换蛋白的生物物理基础、进化机制、预测与设计进展，为拓展蛋白质折叠空间认知提供依据。
主要关键技术方法概述
研究人员综合已发表实验与计算研究进行综述分析：通过PDB数据库检索相同/近似序列具不同二级结构及功能解释的区域鉴定fold switchers；采用核磁共振（NMR）化学交换饱和转移（CEST）、zz-exchange及CPMG弛豫色散实验观测构象交换动力学；利用氢氘交换质谱（HDX-MS）和尺寸排阻色谱验证中间态与寡聚化关联；应用基于结构模型（SBM, structure-based model）的单盆地与双盆地能量景观模拟、副本交换分子动力学（REMD, replica exchange molecular dynamics）及隧道副本交换（RET）探究折叠转换路径；借助多序列比对（MSA, multiple sequence alignment）与进化耦合分析（evolutionary couplings）识别双折叠共进化信号；使用CF-random（随机序列采样结合AlphaFold2）及JPred4二级结构不一致性预测潜在fold switchers；通过祖先序列重建（ASR, ancestral sequence reconstruction）与系统发育树分析fold switching的进化起源。
论文主体结果与结论
1. INTRODUCTION（引言）
研究人员指出经典观念认为同源蛋白具相似结构，而fold-switching proteins证明高度同源甚至相同序列可编码多重稳定折叠。该现象挑战了序列-结构一一对应关系及现有AI预测模型，引出三个核心问题：单序列如何编码双折叠、同源序列何以产生不同折叠、fold switchers为何难预测。
2. ONE SEQUENCE, TWO FOLDS（一条序列，两种折叠）
Fold switchers与典型别构蛋白（allosteric proteins）不同，后者多为刚性或局部重排而不重塑二级/三级结构，fold switchers则响应结合配体、pH、温度、膜插入或寡聚化触发二级结构重排。研究人员以三种典型分子为例：（1）大肠杆菌RfaH的C端结构域（CTD）在未结合时呈α螺旋发夹遮蔽N端RNA聚合酶结合位点，结合RNAP和ops DNA后CTD解离重折叠为KOW β滚折叠结合核糖体亚基；（2）人趋化因子XCL1生理条件下平衡存在单体趋化因子折叠（激活XCR1受体）与二聚β折叠（结合病原体），涉及β折叠氢键网络重注册与疏水核重排；（3）聚球藻KaiB基态四聚体C端为βααβ折叠，单体化后结合KaiC时转为硫氧还蛋白样αββα折叠，Pro顺反异构化调控慢速转换（小时级）以维持昼夜节律24小时周期。表明fold switching可由完全重排α?β至局部二级结构变化。
3. BIOPHYSICAL PROPERTIES OF FOLD-SWITCHING PROTEINS（折叠切换蛋白的生物物理特性）
3.1. Protein Energy Landscapes（蛋白质能量景观）
单折叠球蛋白能量景观为单深势阱，固有无序蛋白（IDPs, intrinsically disordered proteins）为宽浅盆地；fold-switching proteins具多极小能量景观（multiple minima），各极小对应一具生物学意义的天然构象（metamorphic proteins可可逆互变）。其折叠自由能ΔGfold常高于?3 kcal/mol（典型球蛋白?15至?5 kcal/mol），边际稳定性利于访问替代构象（>1%当ΔGfold≥?2.3 kcal/mol）。冷变性可调节两构象相对布居——一构象低温稳定高温不稳，另一反之，温度位移可使平衡偏移。
3.2. Experimentally Characterized Mechanisms of Interconversion（已通过实验表征的互变机制）
NMR研究显示大尺度构象转换通常为秒或更慢（RfaH CTD α?β经α/β杂交中间体秒级交换；XCL1 α/β→全β秒级；Sa1 V90T温度敏感切换秒级；KaiB小时级且经历部分无序态）。部分区域可独立于蛋白主体去折叠/重折叠，经由部分去折叠中间体桥接两折叠态。X射线晶体学偏向最稳定构象故难捕获动态过程，NMR CEST、zz-exchange及CPMG是主要观测手段。
3.3. Molecular Dynamics Simulations（分子动力学模拟）
经典MD因fold switching时标（秒级）采样困难。研究人员采用结构基础模型（SBMs）——单盆地SBM描述单折叠蛋白漏斗形景观，双盆地SBM对各天然拓扑加入独立能量项成功捕捉XCL1、Mad2、ClyA、流感HA、SARS-CoV-2 Spike、RfaH CTD及KaiB的转换路径，计算提示KaiB二聚体解离为其fold switching关键步骤并经突变体验证。副本交换分子动力学（REMD）及带隧道的RET增强采样可跨越能垒描绘RfaH CTD自由能面；扩展MD结合主成分分析表征XCL1热力学景观。
4. PROTEIN FOLD SWITCHING AND EVOLUTION（蛋白质折叠切换与进化）
4.1. Proteins with Similar Sequences but Different Folds（序列相似但折叠不同的蛋白）
Paracelsus Challenge工程证明≤50%序列改变可实现折叠/功能切换，Janus蛋白（50%相同于蛋白G B1结构域）兼四螺旋束与β折叠特征；后续工作实现98%相同序列不同折叠乃至100%相同序列三蛋白不同折叠，单点突变可触发三螺旋束?α/β-grasp切换。表明折叠空间具流动性。此外，可变剪接（BCCIP α/β亚型80%相同序列RMSD>10 ?不同折叠互作不同伙伴）及SNP（MEF2B D83V致α→β切换关联非霍奇金淋巴瘤）亦可诱导fold switching，PTM（如Orf9b磷酸化）可能为触发因素。
4.2. Roles of Fold-Switching Proteins in Evolution（折叠切换蛋白在进化中的作用）
Fold switchers可为进化中间体或受选择的终产物。通过ASR与系统发育分析发现：（1）进化出的fold switching（evolved fold switching）：细菌响应调节子C端结构域经逐步突变HTH（helix-turn-helix）→wH（winged-helix）折叠，中间序列桥接两家族，ASR+AlphaFold2示突变促折叠转换扩展DNA结合特异性；（2）适应性fold switching：XCL1为单系起源（monophyletic），丢失保守二硫键积累突变获二重态；RfaH为多系独立起源（polyphyletic）于NusG家族不同分支。双折叠共进化（dual-fold coevolution）在56个已知fold switchers中被识别——各构象独特氨基酸接触共进化，信号源自fold-switching蛋白亚家族而非整个超家族。
5. NEW FOLD SWITCHERS THROUGH PREDICTION AND DESIGN（通过预测与设计发现新折叠切换蛋白）
5.1. Predicting Fold Switchers from Their Sequences（从序列预测折叠切换蛋白）
AlphaFold2/3、ESMfold等倾向预测MSA主导共进化信号对应构象，忽略弱信号替代折叠甚至被训练集记忆偏差误导（如RfaH AF2预测α螺旋因训练集含此构象）。AF-cluster依赖训练集记忆而非共进化推理。基于JPred4 MSA二级结构预测不一致性成功预报NusG家族24%成员具α?β转换（10/10实验验证）。CF-random（随机序列采样+AlphaFold2）对已知fold switchers优于AF-cluster，对大肠杆菌2126个蛋白筛查预估5%可能switch folds，经双折叠共进化（ACE, alternative contact enhancement）过滤得候选者（如MinE）。当前成功率约35%，仍需改进。
5.2. Designing New Fold Switchers（设计新折叠切换蛋白）
早期设计Sw2 pH/金属离子触发锌指?三聚卷曲螺旋切换；定向进化+理性设计获98%相同序列不同折叠蛋白及温度敏感Sa1 V90T。扩散模型尝试设计α/β蛋白半区为全α螺旋，深度学习用于铰链运动及动态蛋白设计，为多重状态蛋白设计提供前景。
6. FUTURE OPPORTUNITIES（未来展望）与SUMMARY POINTS（总结要点）
研究人员总结：（1）fold switchers挑战传统蛋白质结构-生物物理-进化观念；（2）PDB中代表性不足反映技术局限，真实生物学范围待定；（3）多阱能量景观受温度等调控，转换慢且经中间体；（4）双重折叠可受正向选择，新折叠可经逐步突变介导出现；（5）实验与计算结合推进认知；（6）已设计出新fold switchers。未来需：可靠从头预测新fold switchers；发展高通量无需纯化的实验筛选法（in-cell FRET、HDX-MS、NMR各有局限）；明确序列特征及可变剪接/SNP如何诱导fold switching。
