叶绿体蛋白导入装置（Chloroplast Import Apparatus）的结构与功能

《Annual Review of Plant Biology》：The Structure and Function of the Chloroplast Import Apparatus

　　

摘要：叶绿体是植物和藻类中进行光合作用的细胞器，其生理功能的维持依赖于数千种核编码蛋白的输入。该过程由外膜转运体（translocon at the outer chloroplast membrane，TOC）、内膜转运体（translocon at the inner chloroplast membrane，TIC）及ATP驱动的导入马达（import motor）协同介导。然而，有关这些关键机器的组成长期存在激烈争议。近期结构生物学研究进展已厘清了上述复合物的组成与架构方面的长期分歧。本综述总结了叶绿体蛋白导入装置最新的结构、功能及演化见解，着重阐述高分辨率结构生物学对重新定义既有范式的变革性作用。 关键词：叶绿体蛋白导入（chloroplast protein import）；TOC-TIC转运体（TOC-TIC translocon）；导入马达（import motor）；Ycf2-FtsHi复合物（Ycf2-FtsHi complex）；冷冻电镜结构（cryo-EM structure）；蛋白跨膜转运（protein translocation）；叶绿体生物发生（chloroplast biogenesis）

论文解读：《叶绿体蛋白导入装置（Chloroplast Import Apparatus）的结构与功能》——发表于Annual Review of Plant Biology**

一、研究背景与意义

叶绿体是植物和藻类的光合细胞器，其超过2000～3000种蛋白由核基因组编码并在胞质合成，以前体蛋白（preprotein）形式携带转运肽（transit peptide）经双层被膜输入叶绿体。该过程由外膜TOC复合物、内膜TIC复合物及基质侧ATP驱动导入马达共同完成。过去四十余年，TIC核心组分的经典模型（含Tic110、Tic40等）与新提出的1 MDa TIC模型（含Tic214、Tic100、Tic56、Tic20、Tic12等）长期并存且争议不断；导入马达也存在分子伴侣模型（Hsp93/cpHsp70/Hsp90C）与Ycf2-FtsHi复合物模型之争。由于缺少天然状态下高分辨率结构，领域共识长期缺失。近年冷冻电镜（cryo-EM）技术使研究人员得以内源纯化并解析TOC-TIC超复合物及导入马达结构，终结了上述争议，为理解叶绿体蛋白导入机制提供全新范式。

二、主要关键技术方法

研究人员采用：（1）拟南芥（Arabidopsis thaliana）和莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中分别对共识亚基Tic20和Toc34进行亲和标签敲入的内源交叉验证纯化策略，获取天然TOC-TIC超复合物；（2）豌豆（Pisum sativum）离体叶绿体蛋白导入实验，利用带亲和标签的前体蛋白捕获转运中间体超大复合物（ultracomplex）；（3）冷冻电镜单颗粒分析解析莱茵衣藻TOC-TIC超复合物、拟南芥TIC复合物及Ycf2-FtsHi复合物高分辨率结构，并将各独立结构拟合至中等分辨率（~11.5 ?）超大复合物图谱中进行组分鉴定与互作验证。

三、研究结果

1. CHLOROPLAST PROTEIN IMPORT TRANSLOCON（叶绿体蛋白导入转运体）

1.1 Historical Models of TOC and TIC（TOC与TIC的历史模型）

TOC组成已达共识：含孔蛋白Toc75（Omp85超家族，具POTRA域及β-桶）、信号识别受体Toc159家族及Toc34家族（均含N端GTP结合域与C端膜锚定域）。TIC则存两模型：经典模型主张Tic110、Tic40为核心伴Tic62/Tic55/Tic32/Tic22/Tic21/Tic20；新1 MDa模型主张Tic214/Tic100/Tic56/Tic20/Tic12（后增补Tic12），不含Tic110/Tic40。Tic20是两模型共有组分。

1.2 The Endogenous Purification and Structural Investigation of TOC-TIC（TOC-TIC的内源纯化与结构研究）

通过对Tic20和Toc34分别标签化交叉验证纯化莱茵衣藻TOC-TIC超复合物，获得一致分子量、蛋白组成及cryo-EM密度图，排除标签假象，确证捕获天然超复合物。高分辨结构显示莱茵衣藻TOC-TIC含14个亚基：TOC亚基Toc120、Toc75、Toc34；1 MDa TIC亚基Tic214、Tic100、Tic56、Tic20、Tic12；新鉴定组分Toc52、Toc39、Toc10、Tic35、Tic13、YlmG。经典模型组分（Tic110、Tic40等）未检出。拟南芥TIC经Tic20标签内源纯化解析，含Tic214、Tic100、Tic56、Tic35、Tic20、Tic12（保守于二者），缺Tic13，TOC因与TIC动态互作未良好解析；同样不含经典TIC组分，证实1 MDa TIC模型为真，经典模型组分非核心转位机器。

1.3 Structures of TOC and TIC Translocons（TOC与TIC转运体结构）

TOC中Toc75与Toc120共组装成杂合β-桶孔道（非Toc75单独成孔），孔口带负电补丁利于结合前体正电转运肽；莱茵衣藻特有Toc39形成额外小β-桶功能待定。TIC主要由跨膜α螺旋构成，Tic20与YlmG围出带侧向开口的亲水腔（腔内带负电、残基保守），构成潜在前体转运路径；拟南芥因缺Tic13致Tic35构象变化形成半开放腔作为替代路径。膜间隙（intermembrane space，IMS）支架蛋白Tic214跨内外膜，表面具亲水沟槽连接TOC与TIC孔道，稳定超复合物并导向底物传递；拟南芥中TOC-TIC互作较动态，允许TOC不同异构体与TIC组合赋予可塑性。

2. CHLOROPLAST IMPORT MOTOR（叶绿体蛋白导入马达）

2.1 Controversial Models of the Chloroplast Import Motor（导入马达的争议模型）

分子伴侣模型认为Hsp93（ClpC，基质Hsp70同源物）/cpHsp70/Hsp90C为马达；Ycf2-FtsHi模型认为含Ycf2、FtsHi1/2/4/5、FtsH12及质体NAD依赖苹果酸脱氢酶（plastidial NAD-dependent malate dehydrogenase，pdNAD-MDH）的~2 MDa复合物为马达。两模型无共有组分，既往生化证据各有局限（免疫共沉淀非特异性、交联假象、pull-down污染可能）。

2.2 Capturing the Translocation Intermediate Ultracomplex（捕获转运中间体超大复合物）

研究人员用豌豆叶绿体进行带标签前体蛋白导入实验，终止于中间阶段亲和纯化获得含TOC-TIC、前体及马达的超大复合物，获~11.5 ?图谱。将已解析TOC-TIC结构拟合入图谱确认其存在，剩余密度对应为马达。

2.3 The Ycf2-FtsHi Complex as the Import Motor（Ycf2-FtsHi复合物为导入马达）

质谱显示超大复合物富集Ycf2-FtsHi组分；拟南芥双标签交叉验证纯化获Ycf2-FtsHi高分辨结构并拟合入超大复合物图谱，精确匹配——直接证实Ycf2-FtsHi为叶绿体蛋白导入马达。分子伴侣模型组分未在超大复合物中出现，表明其不直接参与核心导入过程。

2.4 Structures of the Ycf2-FtsHi Complex（Ycf2-FtsHi复合物结构）

拟南芥Ycf2-FtsHi含已知7组分加新鉴定AtTam46/AtTam38/AtTam37/AtTam9（突变致胚胎致死或白化表型）。基质侧形成异六聚AAA⁺ATP酶马达模块（Ycf2-FtsHi1-FtsHi2-FtsHi4-FtsHi5-FtsH12），Ycf2缺失Walker B、精氨酸指及亚基间信号（ISS）基序且不结合/水解ATP，5个FtsHi亚基缺HEXXH锌结合基序（FtsH12具HEXXH但非必需），表明由AAA⁺蛋白酶演化而来、专司导入。ATP结合态见FtsHi4与FtsH12结合ATP，其余具柔性。莱茵衣藻Ycf2-FtsHi含19亚基（含Fhl1、Fhl3、Ctap1、Ctap6等），跨绿藻与陆生植物保守。

2.5 Translocon–Motor Cooperation（转运体与马达协作）

超大复合物结构显示Ycf2-FtsHi跨膜区与TIC共位于内膜（inner envelope membrane，IEM），IMS支架亲水沟槽朝向马达，马达模块精确位于TIC的Tic20下方；Ycf2-FtsHi附属亚基使马达模块相对内膜倾斜，促进前体从TIC向马达高效递送，该倾斜角度在莱茵衣藻中保守。

3. EVOLUTIONARY CONSERVATION AND DIVIVERSITY（演化保守性与多样性）

TOC较保守，莱茵衣藻具特异组分。TIC核心（Tic214/Tic100/Tic56/Tic35/Tic20/Tic12）与Ycf2-FtsHi马达保守于多数绿色谱系（绿藻、苔藓、蕨类、双子叶、单子叶如天门冬科和棕榈科），红藻与灰胞藻多缺如，暗示绿色谱系分化后演化。禾本科（Poaceae）因基因组重排可能丢失相关基因，或采用替代导入系统。莱茵衣藻TOC-TIC及马达富含翻译后修饰（如磷酸化）及MGDG/DGDG/SQDG脂质互作，拟南芥少见，体现物种特异性调控层次。

四、讨论与结论总结（译自SUMMARY POINTS）

1. 1.
   大多数叶绿体蛋白为核编码，经由外膜转运体（TOC）与内膜转运体（TIC）复合物导入，并由ATP驱动导入马达供能。
2. 2.
   TOC核心组分为Toc75、Toc159/Toc120/Toc132/Toc90及Toc34/Toc33；TIC核心组分为Tic214、Tic100、Tic56、Tic35、Tic20、Tic12及YlmG。
3. 3.
   Ycf2-FtsHi复合物行使叶绿体蛋白导入马达功能，其马达模块由Ycf2、FtsHi1、FtsHi2、FtsHi4、FtsHi5和FtsH12组成，借附属亚基锚定于叶绿体内膜。
4. 4.
   TOC、TIC与Ycf2-FtsHi协作形成超大复合物以实现高效蛋白导入。
5. 5.
   TOC跨物种较保守；TIC核心与导入马达在多数绿色谱系中保守，而附属亚基在陆生植物与绿藻间存在差异。