植物—微生物互作中的细胞外囊泡与细胞外RNA

《Annual Review of Plant Biology》：Extracellular Vesicles and Extracellular RNAs in Plant–Microbe Interactions

　　

摘要：植物与微生物之间会交换RNA和蛋白质等大分子。此类交换如何实现尚未得到充分阐明，但细胞外囊泡（EVs）一直被提出为最可能的运输载体。该综述总结了近年来关于植物EVs生物发生及其功能的研究进展，并系统评估了支持或反对其参与跨界RNA干扰（cross-kingdom RNA interference）的现有证据。植物EVs与其他生命界的EVs类似，部分通过多囊泡体（MVBs）与质膜（PM）融合而释放，这一过程属于复杂且保守的机制，涉及脂质修饰蛋白、外排体复合体（exocyst complex）以及Rab GTP酶（Rab GTPases）。尽管部分植物EV亚群参与免疫过程，但现有证据表明植物EVs不太可能对跨界RNA干扰作出实质性贡献。最新研究显示，植物会向叶片质外体（apoplast）及叶表分泌囊泡外RNA（extravesicular RNA），其中包括小RNA和长链非编码RNA（lncRNA），而EVs内部仅检测到极少量RNA。研究人员据此提出，这些游离的细胞外RNA在维持健康叶际微生物组方面发挥核心作用。

该文发表于《Annual Review of Plant Biology》，是一篇聚焦植物—微生物互作中细胞外囊泡（EVs）与细胞外RNA（exRNA）的综述性论文。文章围绕一个长期未解的重要问题展开：植物与微生物之间蛋白质、脂质和核酸等大分子究竟如何跨越细胞壁与膜系统实现交换。既往研究中，EVs由于具有脂质膜包裹结构、可保护RNA免于细胞外核糖核酸酶降解，并且在动物体系中已被广泛讨论为信息分子运输载体，因此被视为植物宿主诱导基因沉默（HIGS，一种由宿主来源RNA触发病原体靶基因沉默的防御机制）最有可能的媒介。然而，植物领域关于EVs真实货载、形成机制、异质性及其在跨界RNA干扰中的作用证据长期有限，且许多结论受到分离纯化方法分辨率不足的制约。在这一背景下，开展系统梳理具有重要意义，因为它不仅关系到植物免疫机制的基础认知，也关系到RNA农药、喷施诱导基因沉默（SIGS）及微生物组调控等应用方向的理论基础。

文章首先指出，植物EV研究真正加速始于可重复的叶片质外体EV分离流程建立之后。随着密度梯度超速离心等方法应用，研究人员得以更严格地区分EVs与其他共同沉降的细胞外颗粒，从而重新审视“RNA主要由EV运输”的经典模型。该综述的中心结论是：植物EVs确实参与免疫，尤其与病原侵染部位的防御反应密切相关；但就现有证据而言，植物EVs不太可能是跨界RNA干扰的主要介质。与之相对，植物会大量分泌囊泡外RNA，这些RNA广泛存在于叶片质外体与叶表面，且很可能才是HIGS以及叶际微生物组稳态维持的关键分子基础。文章的重要意义在于，它推动研究重心由“EV内RNA货载”转向“囊泡外RNA库及其生态功能”，为植物RNA分泌、跨界调控和宿主—微生物共生/致病关系研究提供了新的概念框架。

作者用于支撑综述判断的关键技术方法，主要包括：基于真空渗入—低速离心获取叶片质外体洗液，再通过差速超速离心与密度梯度超速离心分离纯化EVs；利用蛋白质组学、脂质组学和小RNA测序（sRNA-seq）比较不同级分中的蛋白与RNA组成；采用RNA酶保护实验、去污剂预处理、RT-PCR与RNA胶体印迹分析RNA是否位于囊泡内部；结合透射电子显微镜、超分辨显微成像、遗传突变体分析及体外病原处理实验，解析EV生物发生、亚群差异及其与病原互作的功能。植物材料主要来自Arabidopsis，也包含sorghum、barley、rice、Nicotiana benthamiana和alfalfa等体系。

在“动物细胞外囊泡与RNA”部分，文章首先概括了EV概念框架。研究人员指出，动物细胞分泌的细胞外颗粒具有明显异质性，包括来源于MVBs与质膜融合的外泌体、由质膜出芽形成的微囊泡，以及凋亡小体。随着分离纯化技术和超分辨显微技术进步，研究显示传统高速沉淀中混有大量非囊泡颗粒，如RNA结合蛋白（RBP）复合物、组蛋白相关结构及其他无膜颗粒。由此得到的重要结论是，许多早期被归因为“EV相关RNA”的分子，实际上并不与EV共分级。文章据此强调，评价EV功能时必须严格考察纯化流程与对照设置。研究人员进一步总结，动物EVs的形成涉及内体分选复合体（ESCRT）、鞘脂/神经酰胺代谢、Rab GTP酶及外排相关因子，而多数细胞外RNA更常以非囊泡形式存在，常与RBP复合或处于可溶性组分中，且tRNA及其衍生片段（tDRs）是最常见的exRNA类型之一。

在“微生物细胞外囊泡与RNA”部分，作者分门别类综述了细菌、古菌、真菌和卵菌的相关认识。革兰氏阴性细菌可通过外膜出芽形成外膜囊泡（OMVs），其货载常含脂多糖（LPS）、膜蛋白和周质蛋白；革兰氏阳性细菌的EVs则需跨越较厚肽聚糖细胞壁。关于RNA，现有证据同样显示核酸在微生物EV中的检出并不稳定一致，tRNA、rRNA及部分小RNA可见于EV相关或游离组分。功能上，细菌OMVs能够携带微生物相关分子模式（MAMPs），诱导植物或动物免疫；真菌EVs则与细胞壁维护、生物被膜形成及毒力相关，部分植物病原真菌或卵菌还被报道能够输出小RNA并劫持宿主AGO蛋白介导病程相关的跨界RNA干扰。作者借此指出，跨界RNA转运确有其事，但“是否必须依赖EV”在多数体系中仍未被严格证明。

在“植物细胞外囊泡与RNA”部分，文章首先回顾了超微结构证据。早在数十年前，研究人员已在胡萝卜愈伤组织及多种植物受侵染组织中观察到位于细胞壁与质膜之间、尤其是所谓旁膜体（PMBs）区域内的大量囊泡；在真菌侵染位点、乳突（papilla）沉积区域以及吸器周围空间，EVs和MVBs均频繁出现。这说明植物EV分泌与病原侵染应答关系紧密。随后，作者总结了植物EV分离技术建立后的基础认识：Arabidopsis EVs富集多种胁迫和防御相关蛋白，如PEN1、PEN3和TET8；单子叶与双子叶植物之间存在较强保守性；不同标志蛋白定义了不同EV亚群，其分泌水平会随病原侵染或免疫激素刺激而变化。关于生物发生，TET8相关EVs被认为与MVB途径有关，外排体复合体（exocyst）、RabA/RabE及植物特异性鞘脂GIPC稳态对特定EV亚群形成十分重要。文章还指出，植物是否分泌典型微囊泡尚无定论，而自噬途径在Arabidopsis中似乎并非EV分泌所必需。

在“EV介导RNA转运与HIGS”部分，作者梳理了支持经典模型的关键证据。HIGS是植物通过表达双链RNA（dsRNA）、反义RNA或人工miRNA，使病原对应基因沉默的现象。部分研究曾在受侵染真菌中检出植物来源小RNA，并证明这些RNA可靶向病原转录本；也有研究报道某些Arabidopsis小RNA与AGO1结合，并与TET8阳性EV级分共分离，由此形成“植物将小RNA及RBP装载入EV，再被病原吸收”的模型。不过，文章紧接着在“非EV介导RNA转运”部分系统提出修正。多项基于RNA酶保护和高分辨率密度梯度分离的研究表明，在健康Arabidopsis中，只有极少数miRNA与EV相关，大多数miRNA、phasiRNA以及其他长于18 nt的RNA并不位于EV内部；感染Colletotrichum higginsianum时，与HIGS相关的miR166等小RNA更主要位于非囊泡级分。与此同时，大多数exRNA在常规超速离心条件下并不沉淀，提示其并不依附于小颗粒；即便能够沉淀，也通常不与TET8等EV标志物共分级，而更多由蛋白复合体或依赖阳离子的细胞壁凝聚结构保护。由此，作者认为植物跨界RNA沉默不应再被单纯归因于EV运输，而应理解为至少包括EV相关、蛋白结合和游离RNA三种分泌形式共同存在，其中囊泡外RNA可能更占主导。

在“非囊泡细胞外RNA及其生物学意义”部分，文章提出全篇最具前瞻性的概念提升。研究人员综合植物与哺乳动物证据指出，多数exRNA属于稳定的无膜RNA群体，并且高度富集tDRs。植物叶片不仅在质外体中存在大量exRNA，叶表面也覆盖着成分复杂的RNA群体，而EV和蛋白在叶表并不丰富。这提示叶表可能是一个此前被忽视的重要RNA储库。文章进一步总结HIGS在真核病原与原核病原中的新认识：无论是SIGS中外源喷施的长dsRNA，还是植物体内表达的发夹RNA（hpRNA），现有证据都支持相当一部分沉默信号可在不依赖EV封装的情况下直接被病原摄取；在Pseudomonas syringae等细菌体系中，植物来源21-nt dsRNA可在质外体外部发挥沉默作用，表明细菌同样能够摄取并响应exRNA。关于叶表RNA的功能，作者结合病原在突破表皮前通常经历的附生阶段指出，沉默RNA的摄取很可能发生于侵入前叶表接触阶段，而非一定要等到病原穿透细胞壁之后。特别值得注意的是，叶表tRNA多保持完整，而质外体中则更常见tRNA半分子和tDRs，这些分子可能像在人类口腔微生物组中那样，直接影响微生物生长与群落结构。

在“病原如何摄取与对抗exRNA”部分，作者总结认为，真菌和卵菌可摄取裸露dsRNA，某些体系可能依赖网格蛋白介导内吞（CME），但受体和内吞后RNA如何逃逸内体仍不清楚；细菌摄取RNA的机制更为未知，可能需要借助类似线粒体选择性导入tRNA的研究框架来探索。另一方面，病原体已演化出多种对抗策略，包括分泌RNA沉默抑制子，干扰宿主DICER、AGO或次级siRNA生成，也可能通过分泌核糖核酸酶降解质外体RNA，从而削弱宿主基于RNA的防御。

讨论部分强调，当前最需要回答的科学问题包括：植物如何分泌EV非依赖性的RNA；植物EV究竟通过何种非RNA货载参与免疫；EV与exRNA如何穿越植物细胞壁；植物体内是否存在以exRNA为介导的细胞间通讯；微生物摄取RNA后的胞内转运机制；以及叶际与根际微生物组是否由宿主分泌RNA主动塑造。作者认为，随着证据积累，植物EV的核心作用更可能体现在免疫、细胞壁重塑、抗菌代谢物输出和病原界面防御，而非大规模运送沉默RNA。相反，囊泡外RNA，尤其是tRNA及其衍生片段，可能是连接宿主防御、跨界基因沉默与微生物生态稳态的关键分子。

研究结论可译为：植物细胞外囊泡参与免疫，尤其与抗真菌病原有关；植物EVs通过依赖外排体复合体（exocyst）和Rab GTP酶的途径分泌，该过程涉及复杂多囊泡体与质膜融合；植物EVs不太可能介导沉默RNA转运；宿主诱导基因沉默（HIGS）更可能由植物分泌的囊泡外RNA介导；HIGS可能在叶表面即由分泌到叶表的沉默RNA启动；植物和哺乳动物中最丰富的细胞外RNA类别是tRNA，其可被加工为可能具有生物学功能的tRNA衍生片段；囊泡外RNA可被细菌摄取并影响细菌基因表达；细胞外RNA可能在维持健康叶际微生物组中发挥核心作用。