编辑推荐：
摘要：类RAF蛋白激酶（RAF-like protein kinases）是植物中促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）的一个主要亚类，在胁迫与激素信号通路中发
摘要：类RAF蛋白激酶（RAF-like protein kinases）是植物中促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）的一个主要亚类，在胁迫与激素信号通路中发挥关键调控作用。与动物同源物不同，植物RAF激酶发生了广泛的扩增与分化，其中B亚组和C亚组表现出保守及特化的双重功能。近期研究表明，它们可感应高渗胁迫和CO2升高等环境刺激，并介导脱落酸（abscisic acid，ABA）、乙烯（ethylene）和生长素（auxin）等激素响应。RAF还参与保卫细胞信号传导、免疫应答及发育过程，整合多种内外信号。本综述总结了植物RAF激酶的现有认知，着重阐述其功能多样性、激活机制及其在植物适应中的生理意义。
论文解读：《植物中的类RAF蛋白激酶（RAF-Like Protein Kinases in Plants）》
该综述发表于《Annual Review of Plant Biology》，系统梳理了植物中类RAF蛋白激酶（RAF-like protein kinases，即类RAF MAPKKKs）的最新研究进展。在哺乳动物中，RAF（RAPIDLY ACCELERATED FIBROSARCOMA）仅有ARAF、BRAF和CRAF三个成员，作为经典MAPK（mitogen-activated protein kinase，促分裂原活化蛋白激酶）级联中的MAPKKK（MAP kinase kinase kinase），磷酸化MAPKK（MAP kinase kinase）进而激活MAPK。相比之下，植物基因组编码多达数十个RAF-like MAPKKKs，且它们不再主要作用于MAPKK，而是进化出激活植物特有的SnRK2（SNF1-related protein kinase 2，蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2）或参与其他非典型信号模块的功能。此前植物RAF激酶除CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE 1（CTR1，亦名RAF1）和ENHANCED DISEASE RESISTANCE 1（EDR1，亦名RAF2）外长期被忽视，近年研究才揭示其在渗透胁迫感知、ABA（abscisic acid，脱落酸）信号、乙烯信号、CO2感知、蓝光响应、免疫及生长发育中的核心作用。本文旨在整合这些发现，阐明植物RAF激酶的分类、激活机制及生理意义。
研究人员通过对拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）及小立碗藓（Physcomitrium patens）中RAF-like MAPKKKs进行系统发育分析完成亚组划分；综合遗传筛选（如渗透胁迫敏感的hydraulic conductivity of root 1/hcr1突变体、乙烯组成型响应的ctr1突变体、CO2不敏感的ht1突变体等）、高阶基因敲除或RNAi突变体（如OK130-null缺失全部B4亚组成员、OK100-oct缺失多个B2/B3亚组成员）、磷酸蛋白质组学比较野生型与snrk2十重突变体、体外激酶 assay 检测RAF对SnRK2激活环（activation loop）Ser/Thr残基的直接磷酸化、活细胞荧光显微术观察高渗诱导的RAF蛋白凝聚（protein condensation）及与SnRK2共定位、免疫共沉淀鉴定RAF互作蛋白（如ETR1、EIN2、PP2C、MKK5等），以及生化重构实验（大肠杆菌共表达或纯化蛋白体外重构RAF–PP2C–SnRK2体系），归纳了各RAF亚组在特定信号通路中的功能与分子机制。
1. INTRODUCTION（引言）
研究人员指出，拟南芥基因组含21个MEKK1-like MAPKKKs和48个RAF-like MAPKKKs（22个B-RAF亚组成员，26个C-RAF亚组成员）及10个ZIK亚组成员。不同于动物RAF主要激活MEK–ERK级联，植物B-RAF亚组多数不直接磷酸化MAPKK，而主要通过磷酸化SnRK2激活环上的保守Ser残基来启动ABA与渗透胁迫信号，部分C-RAF则参与保卫细胞CO2/蓝光信号或作为典型MAPKKK激活MKK–MPK级联。这一定义了植物特有的RAF–SnRK2信号范式。
2. THE CLASSIFICATION OF RAF-LIKE PROTEIN KINASES IN PLANTS（植物类RAF蛋白激酶的分类）
通过对P. patens、拟南芥和水稻的RAF-like MAPKKKs进行系统发育分析，研究人员将其分为B组（B1–B4四个亚组）和C组（C1–C7七个亚组）。拟南芥具B1(若干)、B2(若干)、B3(含CTR1、EDR1等8个)、B4(7个，含RAF16/HCR1/RAF24/RAF18/RAF20/RAF35/RAF42)；C组含C1(含BHP/ILK5/ILK1/VIK)、C2(含STY8/STY17/STY46)、C3、C4(仅拟南芥有3个)、C5(含HT1/RAF19、RAF36)、C6(含RAF22)、C7(含CBC1/RAF38、CBC2/RAF33、RAF48/MRK1/RAF26/RAF39)。P. patens和单子叶、双子叶植物间成员数目与亚组分布存在差异，反映RAF激酶的古老起源与进化可塑性。
3. B RAFs IN ENVIRONMENTAL SENSING AND ADAPTATIONS（B组RAF在环境感知与适应中的作用）
3.1. CTR1 Negatively Regulates Ethylene Signaling（CTR1负调控乙烯信号）
研究人员综述：CTR1（RAF1）定位于内质网（ER）胞质侧，无乙烯时与活性乙烯受体ETR1形成复合物，磷酸化EIN2（ETHYLENE INSENSITIVE 2）的Ser645和Ser924，使EIN2滞留于ER并被26S蛋白酶体降解，抑制乙烯响应；乙烯结合ETR1使CTR1失活，EIN2 C端剪切入核启动EIN3/EIL1依赖的乙烯响应基因表达。CTR1还可被PP2A亚基、磷脂酸及长链神经酰胺调控，乙烯刺激下可转位入核稳定EIN3（不依赖激酶活性）。此外CTR1磷酸化叶绿体TOC复合物的Toc33，sis1（ctr1等位基因）表现蔗糖不敏感，暗示其超越乙烯信号的额外功能。水稻OsCTR1/OsCTR2除保守途径外涉及低温胁迫与ABA拮抗气孔关闭；P. patens的PpCTR1L（ANR/PpARK）介导乙烯、ABA及渗透胁迫信号。
3.2. Osmotic Stress Sensing and Early Signaling（渗透胁迫感知与早期信号）
研究人员指出，高渗胁迫诱导ABA非依赖和依赖途径汇聚激活SnRK2（I亚类SnRK2.1/2.4等及III亚类SnRK2.2/2.3/OST1）。苔藓PpARK（PpCTR1L，B2/B3亚组）直接磷酸化SnRK2B激活环Ser，ark突变体丧失ABA与高渗触发的SnRK2激活。拟南芥B4亚组RAF（RAF18/RAF20/RAF24/RAF40(HCR1)/RAF16/RAF35/RAF42）经高渗（甘露醇/NaCl/PEG）快速磷酸化并发生可逆性蛋白凝聚（依赖长内在无序区IDR），凝聚将I亚类SnRK2招募入核心凝聚体，物理隔离A族PP2C（如HAB1），并在凝聚体内磷酸化激活SnRK2。OK130-null（七成员全缺）对轻微高渗超敏感且丧失SnRK2激活。B2/B3亚组RAF具基础激酶活性，在高渗下也被激活（晚于B4），主要磷酸化III亚类SnRK2（SnRK2.2/2.3/OST1）并参与ABA信号。B4 RAF凝聚不受OSCA1或DCP5缺失影响，Ca2+螯合可模拟高渗诱导B4 RAF超磷酸化，提示离子敏感性而非典型钙依赖机制。
3.3. Abscisic Acid Signaling（脱落酸信号）
在无ABA时A族PP2C去磷酸化SnRK2激活环Ser171/Ser175（OST1编号）使其失活；ABA结合PYR1/PYL/RCAR使PP2C受抑释放SnRK2。研究人员总结：拟南芥B2/B3亚组RAF（RAF3/RAF4/RAF5/RAF7/RAF8/RAF9/RAF10/RAF11及保卫细胞富集的B1亚组RAF15）具基础激酶活性，直接磷酸化SnRK2激活环保守Ser启动SnRK2自磷酸化放大信号。此基础活性受P-loop保守Ser（如RAF3-Ser619）磷酸化水平调控——无ABA时A族PP2C去磷酸化该Ser维持RAF ATP结合与基础活性；ABA解除PP2C对SnRK2抑制后RAF磷酸化SnRK2；SnRK2激活后RAF自磷酸化P-loop Ser阻断ATP结合使其"重置"，待胁迫消退PP2C再去磷酸化恢复。OK100-oct/nONU（缺8–9个B2/B3 RAF）萌发与幼苗生长ABA不敏感，SnRK2.2/2.3/OST1不被ABA激活。CTR1和EDR1（RAF2，B3）重组激酶域可体外磷酸化SnRK2.6但全长蛋白在OK100-oct中不能恢复ABA诱导报告基因，提示二者可能非ABA–SnRK2直接激活子。C组RAF22（C6）和RAF36（C5）可磷酸化ABI1增强其磷酸酶活性，ABI1去磷酸化激活RAF22，OST1磷酸化RAF22形成反馈调节。RAF12（B2）可磷酸化抑制PP2C HAI2活性，但过表达RAF12致ABA/NaCl不敏感，提示其负调控ABA信号。
3.4. CO2Sensing and Signaling（CO2感知与信号）
研究人员综述：高大气CO2促气孔关闭依赖C组RAF——HT1（RAF19，C5）磷酸化SnRK2.6(OST1)削弱其激活SLAC1阴离子通道抑制气孔关闭；HT1磷酸化CBC1（C7亚组RAF38）Thr256/Ser280抑制气孔关闭。低CO2下HT1激活CBC1/CBC2（RAF33）；高CO2时碳酸酐酶将CO2转为HCO3?，HCO3?促使MPK4/MPK12与HT1形成异二聚体抑制HT1激酶活性，解除对CBC1抑制促气孔关闭。ht1突变体高CO2下叶温高（气孔不关），cbc1 cbc2双突变气孔组成型关闭不响应CO2变化。SnRK2.6(OST1)为CO2诱导气孔关闭所必需，PYL1等ABA受体缺陷延迟但不消除CO2/HCO3?信号，提示CO2与ABA通路在OST1水平汇合，B-RAF（激活OST1）可能也参与CO2信号值得探究。ht1、mpk12 mpk4-gc、cbc1 cbc2突变体均废除气孔升温响应，暗示保守的保卫细胞CO2感知机制。
3.5. Light and Temperature Signaling（光与温度信号）
ht1突变削弱红光诱导气孔开放（与OST1遗传互作）。CBC1受PHOT1（phototropin 1，蓝光受体）磷酸化Ser43/Ser45（区别于CO2诱导位点），短脉冲蓝光增强CBC1磷酸化并抑制HCO3?激活的S型阴离子电流。C组RAF——BHP（BLUE LIGHT–DEPENDENT H+-ATPase PHOSPHORYLATION，亦名RAF27/ILK5）为保卫细胞蓝光响应所需，蓝光下bhp突变体气孔开放受损且质膜H+-ATPase磷酸化降低，BHP与BLUS1互作但未被其磷酸化。VIK（RAF17，VH1-interacting kinase，C1）也参与蓝光诱导气孔关闭。表明C亚组RAF广泛参与保卫细胞光信号。
4. RAFs IN PLANT IMMUNITY（RAF在植物免疫中的作用）
4.1. EDR1 Negatively Regulates Plant Immunity（EDR1负调控植物免疫）
edr1突变体组成型增强对白粉菌和细菌抗性伴防御基因上调，依赖SA信号（nim1/pad4/eds1抑制edr1表型）。EDR1激酶活性对非必需，主要通过蛋白互作行使功能：结合E3连接酶KEG（调控ABI5泛素化降解）、MKK4/MKK5（负调控其积累）、ATL1 E3连接酶（抑制其活性），并与RLP53-SOBIR1-BAK1复合体关联负调PTI。edr1中MPK3磷酸化MAPKKK5增强MAPK级联活化与抗病。其他B3 RAF（RAF3/RAF4/RAF5）也负调免疫，OK100-nonu中免疫相关基因上调。
4.2. Extracellular ATP Signaling（胞外ATP信号）
eATP作为DAMP被质膜受体P2K1（DORN1）感知，激活P2K1磷酸化C1亚组BHP/ILK5（Ser192），ILK5与MKK5互作并磷酸化MKK5激活MPK3/MPK6级联，ilk5突变体MPK激活受损且感病加重，确立ILK5在eATP–MKK5–MPK3/6免疫通路中作用。另一C组ILK1与CML9互作受抑，参与免疫与K+缺乏时HAK5积累。C7亚组RAF48(MRK1)/RAF26/RAF39冗余介导免疫ROS产生；C2亚组STY8/STY17/STY46负调灰霉菌抗性与MKK7互作降其积累并参与叶绿体分化；C5亚组RAF36磷酸化MKK2负调致病疫霉抗性。
5. RAFs IN AUXIN SIGNALING AND GROWTH REGULATION（RAF在生长素信号与生长发育调控中的作用）
B4亚组RAF在五种陆生植物中受生长素快速磷酸化，praf（地钱）及OK130-null（拟南芥）丧失生长素诱导胞质流动，表明B4 RAF介导生长素超快磷酸化与早期细胞响应。C1亚组VIK（RAF17）磷酸化并稳定LBD18（LATERAL ORGAN BOUNDARIES-DOMAIN 18），磷酸化ERF13致其降解，双向精细调控生长素诱导侧根发生。RAF12过表达提早开花、生物量增，转录受生长素诱导。VRF1/RAF37可变剪接产异构体竞争性结合MKK1不同位点，作为分子开关介导干旱逃避早花转换。B4亚组RAF24磷酸化HUB2（HISTONE MONO-UBIQUITINATION 2）调控开花。B1亚组RAF13与AGC激酶IREH1互作促非胁迫下生长，渗透胁迫下PP2A抑制此模块。水稻raf-B1突变体早花、结实率降，暗示多RAF参与发育。
6. OUTLOOK（展望）与SUMMARY POINTS（要点总结）
研究人员总结：植物RAF是MAPKKK大家族扩增分化产物，B组主要通过磷酸化SnRK2（非MAPKK）定义植物特有信号范式；B4 RAF作为高渗感受器经胁迫诱导凝聚启动高渗信号；B2/B3 RAF为ABA信号所需提供基础活性快速激活SnRK2；C组RAF整合CO2、光、eATP等特别是保卫细胞信号；RAF通过激酶依赖及独立机制（如EDR1蛋白互作、BHP激活MKK5经典MAPKKK功能）协调胁迫、免疫与生长；部分RAF具多重功能（B4介导渗透与生长素快速响应，BHP参与eATP与蓝光），部分具细胞类型特异性专化功能（RAF15保卫细胞ABA–OST1，HCR1/RAF40低氧下K+摄取）。未来需解析RAF如何整合多元信号、凝聚体组分与信号传递、直接底物鉴定、快速感知分子机制、在其他胁迫中角色、与经典MAPK级联互作、活体时空分辨率提升、细胞间通讯作用及作物抗逆改良潜力。
讨论与结论翻译（研究结论部分）：
在哺乳动物细胞中，生长因子等胞外信号激活Ras并启动Raf–MEK–ERK级联；植物拥有数十个RAF激酶且绝大多数缺乏典型酪氨酸激酶与Ras GTP酶，暗示其通过独特机制激活。现有证据表明RAF可作为高渗胁迫感受器，或与ETR1（乙烯信号）、MPK12/MPK4（CO2感知）、P2K1（eATP感知）等受体偶联。植物B/C-RAF多磷酸化SnRK2或其他非激酶效应物而非经典MAPKK，但少数（如BHP/ILK5）可作真正MAPKKK磷酸化MKK5激活MPK3/6。部分RAF（如EDR1）通过直接蛋白互作不依赖激酶活性调控靶蛋白。RAF在信号感知/接收至转导的多层次运作——激酶依赖与独立机制均有——其激活机制及下游靶点仍是未来关键课题。某些RAF整合多重生物学过程（B4 RAF冗余介导生长素快速响应与渗透感知；BHP参与eATP与蓝光信号），提示RAF作为多样上游信号汇聚调控共同下游事件的枢纽。B亚组RAF含保守N端内在无序区（IDR），高渗下发生凝聚招募SnRK2形成核心凝聚体传递渗透信号，也可作为支架蛋白促进信号复合体组装。部分RAF因细胞类型分布及互作伴侣不同而具功能特异性（如RAF15与OST1富集保卫细胞精确控气孔）。需注意RAF凝聚态与亚细胞定位具动态性，实验须防无意高渗预处理导致预激活。综上，类RAF蛋白激酶是植物中高度保守且多功能信号调控家族，通过典型与非典型机制整合环境与激素信号调控生长、胁迫响应及免疫。
