在人源γδ TCR靶向替换小鼠模型中增强抗原特异性B细胞免疫

《Frontiers in Immunology》：Targeted replacement of human γδ TCR in mice enhances antigen-specific B cell immunity

　　

人源化（humanized, Hu）γδ T细胞受体（T cell receptor, TCR）-T1（γδ HuTCR-T1）小鼠模型为在体内研究类人免疫反应提供了一个新颖且多用途的平台。本研究评估了γδ HuTCR-T1小鼠与野生型（wild-type, WT）对照小鼠在胶原和角蛋白抗原免疫后适应性免疫与体液免疫反应的差异。γδ HuTCR-T1小鼠表现出显著增强的B细胞活性，具体表现为抗原特异性抗体分泌细胞（antibody-secreting cells, ASCs）显著增加，血清中抗原特异性IgG、IgA和IgE滴度升高，以及脾脏和外周血组织中浆细胞与记忆B细胞群体扩增。除B细胞应答增强外，γδ HuTCR-T1小鼠还表现出独特且动态的细胞因子谱，其特征为白细胞介素（interleukin, IL）-4、IL-6、IL-10、IL-17、转化生长因子β（transforming growth factor β, TGFβ）、干扰素γ（interferon γ, IFNγ）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNFα）产生增加，反映出促炎与抗炎并存的平衡免疫环境。值得注意的是，抗核抗体（anti-ANA）血清水平始终低于检测阈值。综上结果表明，人γδ T细胞可通过直接细胞相互作用及细胞因子驱动机制调节适应性免疫和体液免疫，并促进B细胞成熟、活化及类别转换。本研究推进了对γδ T细胞作为免疫稳态关键调控者的认识，并凸显γδ HuTCR-T1模型作为临床前研究转化资源的重要价值。

该论文发表于《Frontiers in Immunology》，核心聚焦于人源化γδ T细胞受体（T cell receptor, TCR）小鼠模型中γδ T细胞对B细胞免疫应答的调控作用。研究背景在于，γδ T细胞位于先天免疫与适应性免疫的交界面，虽然数量少于αβ T细胞，但在免疫监视、早期免疫应答和抗体生成中具有重要功能。然而，γδ T细胞与B细胞之间的相互作用长期缺乏充分研究，尤其缺少能够在体内模拟人类γδ T细胞生物学特征的生理相关模型，这在一定程度上限制了其在疫苗研究、免疫治疗和转化医学中的应用。既往研究提示，γδ T细胞能够通过直接细胞接触及细胞因子信号为未成熟B细胞提供“先天性辅助”，促进其成熟为抗体分泌细胞，并影响体液免疫应答的强度、特异性和质量。研究团队此前已构建γδ HuTCR-T1小鼠，并观察到该模型脾脏B细胞比例升高，因此有必要进一步明确该模型中抗原刺激后的B细胞应答特征及其免疫学意义。

为此，研究人员以胶原和角蛋白作为免疫原，比较γδ HuTCR-T1小鼠与遗传背景匹配的野生型（wild-type, WT）小鼠在免疫后的B细胞和体液免疫应答差异。研究结论显示，人源γδ TCR替换可显著增强抗原特异性B细胞免疫，表现为抗体分泌细胞增加、抗原特异性抗体滴度升高、记忆B细胞和浆细胞扩增，并伴随多种免疫调节性与促炎性细胞因子水平上升，而抗核抗体（anti-ANA）未见异常升高。这说明人源γδ T细胞可在不诱发明显自身反应性抗体的前提下，增强针对外源抗原的适应性体液免疫应答。该研究的重要意义在于，为理解γδ T细胞在免疫稳态和B细胞激活中的调控作用提供了体内证据，同时证明γδ HuTCR-T1模型具有较高的转化潜力，可用于临床前免疫学研究。

在技术方法方面，研究人员首先利用Ingenious TruHumanization平台构建γδ HuTCR-T1小鼠，并使用6–8周龄小鼠及其遗传背景匹配WT对照。通过腹腔注射人角蛋白或人Ⅰ型胶原联合弗氏佐剂进行基础免疫和连续4周加强免疫；随后采集外周血与脾脏样本，分离单个核细胞（mononuclear cells, MNCs）。应用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测血清抗原特异性抗体和细胞因子水平，采用ELISPOT检测抗体分泌细胞（ASCs），并通过流式细胞术分析记忆B细胞与浆细胞群体变化。统计分析包括单因素方差分析、Mann-Whitney检验及Spearman相关分析。

在结果部分，论文按照多个小标题系统呈现了γδ HuTCR-T1小鼠中增强的B细胞免疫应答特征。

Gamma delta humanized T cell receptor mice show enhanced antibody-secreting cells response and serum antibody titers following keratin and collagen immunizations
该部分主要通过ELISPOT和ELISA证实，人源化γδ TCR可显著放大抗原特异性体液免疫。研究显示，角蛋白和胶原免疫4周后，γδ HuTCR-T1小鼠外周血和脾脏中的抗原特异性IgG³抗体分泌细胞（ASCs）数量显著高于WT小鼠；脾脏中的抗原特异性IgM ASCs也显著升高。进一步相关性分析发现，γδ HuTCR-T1小鼠外周血与脾脏中的角蛋白特异性IgG³ ASCs之间存在相关性，脾脏IgG³ ASCs与IgM ASCs之间也存在相关性，提示局部和系统性抗体生成具有一致性。同时，血清中抗原特异性IgG³和IgM滴度均明显升高，并且二者在胶原或角蛋白免疫背景下具有相关性。除上述亚型外，γδ HuTCR-T1小鼠的抗原特异性IgG2b、IgG2c、IgA、IgG和IgE滴度也高于WT，而IgG1差异不明显，抗核抗体未检出。该结果说明，人源γδ TCR替换不仅增强抗体生成总量，也促进更广泛的免疫球蛋白类别应答，提示B细胞活化和类别转换过程被同步增强。

Collagen and keratin immunizations increased the frequencies of memory and antibody-secreting plasma B cells in γδ HuTCR-T1 mice
这一部分主要通过流式细胞术分析B细胞亚群，说明人源γδ TCR替换促进了抗原经验性B细胞库的扩增。研究以CD138⁺CD27⁺表型界定记忆B细胞，结果显示，经胶原或角蛋白免疫后，γδ HuTCR-T1小鼠脾脏和血液单个核细胞中记忆B细胞比例均显著高于WT对照。该变化与先前观察到的抗原特异性ASCs增加和血清抗体滴度升高相一致，提示该模型不仅增强短期效应性体液免疫，也有利于形成具有持续应答潜能的记忆B细胞群体。

Figure 3所对应结果进一步分析了抗体分泌浆细胞群体。研究采用CD138⁺CD267⁺CD44⁺表型识别抗体分泌浆细胞，发现免疫后γδ HuTCR-T1小鼠脾脏和外周血中的该类细胞频率显著高于WT小鼠。由于这一表型组合可同时覆盖早期浆母细胞和成熟浆细胞，因此结果有力支持了γδ HuTCR-T1小鼠在抗原刺激后具备更强的浆细胞分化能力。结合ASCs和血清抗体结果，研究证明人源γδ TCR表达与更强的抗原特异性体液免疫形成密切相关。

Keratin and collagen immunizations enhanced the cytokines levels in serum of γδ HuTCR-T1 mice
该部分通过ELISA测定血清细胞因子，揭示增强的B细胞应答伴随更为活跃且复杂的细胞因子环境。结果显示，γδ HuTCR-T1小鼠在免疫后IL-4、IL-10和TGFβ等免疫调节性细胞因子水平显著升高，同时IFNγ、TNFα、IL-6和IL-17等促炎性细胞因子也明显增加。这表明，胶原和角蛋白免疫在γδ HuTCR-T1小鼠中诱导了混合型细胞因子谱，而非单一方向的免疫偏倚。由于IL-4、IL-10和TGFβ与B细胞分化、抗体生成和类别转换密切相关，而IL-6、IFNγ、TNFα和IL-17可反映广泛免疫激活状态，因此这些结果支持γδ T细胞可能通过细胞因子网络参与调节B细胞功能。不过，作者也明确指出，这些细胞因子的具体功能后果仍需进一步机制性实验验证。

讨论部分对上述发现进行了整合。研究人员指出，正常小鼠脾脏中Vγ1和Vγ4是主要γδ T细胞亚群，且二者在B细胞免疫调节中可能发挥相反作用。既往敲除模型研究表明，γδ T细胞缺失会显著改变总Ig水平和自身抗体产生，说明γδ T细胞在维持基础B细胞活性与抗体稳态中具有内在作用。在γδ HuTCR-T1模型中，研究人员以人Vγ9、Vγ10、Vγ11替换小鼠内源Vγ1区域，并在δ位点引入人Vδ1-Vδ8及相应D、J元件，从而使小鼠能够产生具有生理相关性人源CDR3序列的γδ TCR。既往基线研究已表明，未免疫状态下HuTCR-T1和WT小鼠的ASCs、细胞因子及B细胞亚群均处于检测下限，因此本研究中增强的免疫现象归因于免疫刺激后的反应差异，而非基础水平偏高。

进一步地，讨论认为，γδ HuTCR-T1小鼠中抗原特异性IgA、IgE、IgG、IgG2和IgG³滴度上升，以及浆细胞和记忆B细胞扩增，提示人源γδ TCR表达可能促进了B细胞活化、免疫球蛋白类别转换和抗体生成。作者引用既往研究指出，γδ T细胞可分泌IL-4、TGFβ和IL-10等细胞因子以支持B细胞分化，也可能通过诱导共刺激分子、调节辅助性T细胞环境等途径间接增强体液免疫。尽管本研究尚未通过共培养、阻断或过继转移等手段直接证明γδ T细胞对B细胞的作用机制，但现有结果已经显示，携带人源γδ TCR的鼠γδ T细胞与增强的抗原特异性体液免疫密切相关。

值得注意的是，在强烈胶原和角蛋白免疫背景下，γδ HuTCR-T1小鼠血清中抗核抗体仍低于检测阈值，这一现象说明该模型中增强的B细胞应答主要偏向免疫原特异性克隆扩增，而未伴随明显病理性自身抗体生成。作者还将该结果与γδ TCR缺陷小鼠进行对比，指出后者常出现总Ig下降以及IgA、IgE等亚类减少，而本研究模型则在不诱发病理性自身反应的情况下增强了外源抗原免疫，提示人源与鼠源γδ TCR库、细胞因子特征或辅助细胞相互作用之间可能存在差异。

论文结论部分可译为：综上所述，本研究证明γδ TCR的人源化可增强对角蛋白和胶原免疫的B细胞应答，其证据包括抗原特异性抗体滴度升高、浆细胞和记忆B细胞频率增加，以及有利于免疫激活的细胞因子谱形成。因此，γδ HuTCR-T1小鼠是研究适应性免疫和体液免疫的有前景模型。这些发现为进一步探索γδ T细胞与B细胞之间的相互对话奠定了基础，并凸显了该模型在推动临床前研究中的潜在价值。