捕食性壶菌属Myxococcus fulvus菌株KS01通过多方面抗真菌机制对棉花发挥生物防治与促生作用

《Frontiers in Microbiology》：Predatory Myxococcus fulvus strain KS01 confers biocontrol and growth promotion in cotton through multifaceted antifungal mechanisms

　　

棉花黄萎病由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起，是全球棉区最具破坏性的土传真菌病害之一，对棉花产量和纤维品质造成严重损失，亟需开发有效且可持续的防控策略。黏细菌（Myxobacteria）是一类具有多细胞社会行为和捕食活性、能够裂解多种微生物的高等原核生物，在植物病害管理中具有重要潜力。基于此前建立的黏细菌微型资源库，研究人员筛选并鉴定了一株具有广谱抗真菌活性的菌株KS01。形态学、保守基因（16S rRNA和gyrB）及基因组核心基因系统发育树分析将该菌株鉴定为Myxococcus fulvus KS01（M. fulvus KS01）。体外试验表明，M. fulvus KS01能够裂解V. dahliae的菌丝和孢子，并显著抑制孢子萌发。无菌发酵滤液和挥发性有机化合物（Volatile Organic Compounds, VOCs）均表现出抗真菌活性。虽然大孔树脂吸附的粗次生代谢物提取物和酸沉淀的粗脂肽提取物未显示抑制活性，但硫酸铵沉淀的胞外粗蛋白组分表现出显著的抗真菌活性。该组分破坏了真菌细胞壁和膜的完整性，诱导胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）积累，裂解孢子并抑制芽管伸长。底物谱分析进一步揭示KS01产生肽酶（peptidases）、脂肪酶（lipases）和糖苷水解酶（glycoside hydrolases），这些可能是关键的生防决定因子。温室盆栽试验显示，利用白星花金龟（Protaetia brevitarsis）粪渣作为发酵基质制备的M. fulvus KS01固体配方剂对棉花黄萎病的防治效果达63.01%，并显著促进棉花幼苗生长。综上所述，M. fulvus KS01是一种具有多重作用机制的有前景的捕食性生防菌株，对棉花黄萎病的可持续管理具有重要应用潜力。

《Frontiers in Microbiology》发表的这项研究聚焦于棉花黄萎病这一制约全球棉花生产的关键土传真菌病害。当前防治策略面临双重困境：化学防治因病原菌抗药性产生、土壤微生物群落破坏及环境污染而受限；抗病育种周期长且易被病原菌快速进化所克服。在此背景下，环境友好的生物防治方法日益受到关注。然而，现有生防研究主要集中于少数几个微生物类群，真菌生防剂以木霉属（Trichoderma）和毛壳属（Chaetomium）为主，细菌生防剂则以芽孢杆菌属（Bacillus）和链霉菌属（Streptomyces）为代表，这种对"已充分研究"菌株的依赖限制了生防资源库的物种和功能多样性。黏细菌作为社会性捕食细菌，具有广布的环境分布，能够通过协同滑行运动和群体捕食裂解消耗其他微生物，并在营养匮乏时形成多细胞子实体产生抗逆性黏孢子。其产生的结构多样的次生代谢物和胞外水解酶在原核生物中仅次于放线菌和芽孢杆菌，是农业和医药天然产物的重要来源。生态学上，黏细菌占据土壤微生物食物网的顶层位置，其捕食活性可直接影响土传病原菌种群，进而调控土壤微生态和植物健康，但其在植物病害生防中的应用潜力尚待深入挖掘。

研究人员从中国新疆维吾尔自治区尉犁县盐碱棉田分离获得黏细菌菌株KS01，通过形态学观察、16S rRNA和gyrB基因的系统发育分析以及基于92个单拷贝核心基因的全基因组系统发育分析，将KS01鉴定为Myxococcus fulvus。该菌株基因组为11,008,792 bp的环形染色体，GC含量69.90%，预测8,670个开放阅读框（Open Reading Frames, ORFs）。基因组分析发现其编码丰富的碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes, CAZymes），包括糖苷转移酶（Glycosyltransferases, GTs）92个、糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases, GHs）71个、碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases, CEs）70个等；antiSMASH预测到一个与土臭素（geosmin）萜类簇100%相似的生物合成基因簇；同时检测到Type VI分泌系统i亚型（T6SSi）及24个与运动和滑行相关的基因，这些可能参与接触依赖性拮抗和"狼群"式捕食行为。

在抗真菌活性方面，KS01对六种测试植物病原真菌均表现出拮抗作用，其中对V. dahliae的抑制效果最强。固体培养基上，KS01细胞向V. dahliae菌丝扩散并密集环绕，导致菌丝塌陷、广泛断裂，接触区域形成网状胞外物质；液体共培养中，V. dahliae生长和产孢明显受到抑制，培养液变澄清，处理样品出现广泛菌丝断裂。无菌发酵滤液显著抑制V. dahliae菌落生长，引起孢子裂解和萌发抑制，24 h和48 h孢子裂解率分别为51.87%和70.93%，孢子萌发抑制率分别为32.65%和52.92%。KS01产生的VOCs在密封平板试验中也显著抑制菌丝生长。

在胞外分泌物活性组分解析中，粗次生代谢物提取物和粗脂肽提取物未显示抑制活性，而硫酸铵沉淀的胞外粗蛋白组分（浓度3.1 mg·mL^-1）表现出显著抗真菌效应：处理菌落边缘出现菌丝塌陷和广泛断裂，孢子数量和芽管生长明显受到抑制。荧光染色表明该蛋白组分破坏真菌细胞壁和膜完整性，并诱导ROS积累：Calcofluor White染色显示细胞壁荧光逐渐丧失；碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色显示6 h开始出现红色荧光累积，12 h增强，提示膜完整性丧失；DCFH-DA探针显示6 h出现显著ROS积累，12 h进一步加剧。

KS01的胞外酶活性和底物谱分析显示，定性平板试验中KS01能够水解淀粉、脱脂牛奶、羧甲基纤维素（Carboxymethyl Cellulose, CMC）、三丁酸甘油酯和 LightC口β-葡聚糖，但几丁质未被水解；定量DNS法测定粗酶液对木聚糖、β-1,3-葡聚糖、酵母葡聚糖、CMC和昆布多糖具有水解活性，对几丁质和普鲁兰多糖无活性。最高比活为木聚糖酶活性53.37 ± 0.09 U·mL^-1和脂肪酶活性51.00 ± 0.14 U·mL^-1。

温室盆栽试验采用白星花金龟粪渣与小麦秸秆按3:1（w/w）混合作为固体发酵基质，接种KS01发酵液（OD₆₀₀=2.0）后30 ℃培养6天，获得终浓度10⁵ CFU·g^-1黏孢子的固体配方剂。在棉花品种"新陆早18号"（抗黄萎病品种）上的试验表明，KS01固体配方剂处理使黄萎病发病率从46.67%降至26.67%，病情指数从33.33降至12.33，防治效果达63.01%。在无病原菌胁迫条件下，KS01固体配方剂显著增加棉花株高、茎粗和主根长，显示出促生效应。

在讨论部分，研究人员指出合成农药的广泛使用加剧了病原菌抗药性、农药残留和土壤退化等问题，而黏细菌作为社会性捕食细菌，是作物保护中尚未充分利用的资源。KS01的防治机制是多因素的，包括接触依赖性捕食（菌丝表面聚集、产生网状胞外物质、诱导菌丝断裂）、VOCs和细胞外发酵滤液的扩散性拮抗，以及胞外蛋白组分的主导作用。该蛋白组分通过破坏细胞壁和膜完整性、触发ROS爆发导致细胞死亡。KS01分泌的多种水解酶（葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶）与其捕食生活方式一致，需要降解猎物细胞壁和膜中的多样化大分子底物。与常规生防菌株相比，KS01的主动捕食机制在复杂土壤环境中可能具有竞争优势。然而，固体发酵工艺参数、施用剂量和时机等仍有待优化，且需通过多样土壤、棉花品种和多季节田间试验验证其稳健性和农艺实用性。

此外，KS01在无病原菌挑战下促进植物生长的机制也进行了探讨。经检测，KS01不具备吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic Acid, IAA）产生、磷酸盐溶解和固氮能力，研究人员提出可能的间接机制：(i) 分泌胞外酶加速有机物周转，增加植物和有益微生物的局部养分可利用性；(ii) 捕食作用抑制有害微生物，改善根际质量；(iii) 与其他土壤微生物的相互作用可能增强养分循环（如氮素矿化）。

研究结论部分指出：本研究成功分离并鉴定了捕食性黏细菌菌株KS01为M. fulvus，该菌株在体外对V. dahliae表现出强拮抗活性。温室盆栽试验进一步证明，以白星花金龟粪渣为发酵基质制备的M. fulvus KS01固体配方剂对棉花黄萎病具有有效防控作用，并显著促进植株生长，凸显其实际应用潜力。机制研究表明KS01分泌的胞外酶——特别是脂肪酶、肽酶和糖苷水解酶——可能在真菌捕食和病原菌抑制中发挥关键作用。总体而言，这项工作将M. fulvus KS01引入为一种有前景的捕食性生防资源，为棉花黄萎病的可持续管理提供了新策略。