《Frontiers in Microbiology》：Rhodamine B/gold nanoparticles-coloaded UiO-66 as a novel probe for highly sensitive and dual-mode detection of Potato virus S in field samples
编辑推荐：
**摘要**
引言：马铃薯病毒S（Potato virus S, PVS）对茄科植物尤其是马铃薯造成严重损害，原因是其广泛感染以及对基于实验室的反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reacti
**摘要**
引言：马铃薯病毒S（Potato virus S, PVS）对茄科植物尤其是马铃薯造成严重损害，原因是其广泛感染以及对基于实验室的反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）检测的依赖。本研究旨在开发一种快速、高灵敏且具有双信号输出的平台，用于PVS的现场检测。
方法：研究人员开发了一种高灵敏的侧流免疫分析（lateral-flow immunoassay, LFIA），基于一种新型核壳结构探针实现了比色和荧光双模式检测。该探针由多孔金属有机框架UiO-66组成，内部封装罗丹明B（rhodamine B, RhB），外部负载金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs），并以3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane, APTES）作为间隔层和粘合剂，标记为UR@APTES@AuNPs。
结果：所开发的LFIA可在15分钟内实现PVS的双模式检测，且与马铃薯病毒X（Potato virus X）和马铃薯病毒Y（Potato virus Y）的交叉干扰可忽略不计。比色模式的检测限（limit of detection, LOD）为31.2 pg/mL，荧光模式为7.6 pg/mL，比传统基于AuNPs的LFIA（LOD = 462.4 pg/mL）低一个数量级以上。此外，该新型LFIA平台成功检测了田间采集的马铃薯叶片中的PVS。
讨论：双模式LFIA展示了快速、经济高效且高灵敏的田间样品PVS现场筛查能力，突显了其在实际应用中的巨大潜力。通过使用相应的特异性抗体，该平台可轻松适用于其他病原病毒的检测。
**论文解读：基于UR@APTES@AuNPs探针的双模式侧流免疫分析用于马铃薯病毒S的高灵敏现场检测**
**研究背景与问题**
马铃薯病毒S（Potato virus S, PVS）是感染茄科植物（尤其是马铃薯）的主要病毒之一，可通过直接接触、昆虫、染毒种薯和土壤等多种途径广泛传播。PVS感染导致马铃薯产量损失3%–20%，在欧洲某些地区甚至高达30%；与其他病毒如马铃薯病毒X（Potato virus X, PVX）和马铃薯病毒M（Potato virus M, PVM）共感染时，产量损失可增至40%–75%。目前尚无针对染毒植物的有效治疗手段，因此对种薯和田间植株进行准确、高效的病毒筛查对于种薯质量控制和抑制病毒传播至关重要。现有PVS检测方法主要依赖酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）和定量反转录PCR（quantitative reverse transcription-PCR, qRT-PCR），虽在实验室条件下具有高分析灵敏度，但存在操作繁琐、处理时间长（4–8小时）、依赖精密仪器和专业人员的局限。传统胶体金基侧流免疫分析（lateral-flow immunoassay, LFIA）虽操作简便、成本低，但灵敏度不足（典型检测限LOD在ng/mL水平）且仅提供单模式读数，可靠性较差。因此，亟需开发快速、高灵敏、可靠的现场PVS检测方法。研究人员利用金属有机框架（metal-organic framework, MOF）UiO-66的高孔隙率和稳定性，结合罗丹明B（rhodamine B, RhB）的荧光特性和金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs）的比色特性，构建了新型双信号探针，用于提升LFIA的灵敏度和可靠性。该研究发表在《Frontiers in Microbiology》。
**研究方法概述**
研究人员采用以下主要关键方法：
1. **探针合成**：通过溶剂热法合成UiO-66，随后将RhB通过π-π堆积和静电作用负载于UiO-66孔道内，获得UR（UiO-66@RhB）。利用3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane, APTES）对UR进行硅烷化修饰，作为间隔层并引入氨基，再通过静电吸附和配位作用将柠檬酸稳定AuNPs负载于UR@APTES表面，形成核壳结构UR@APTES@AuNPs。
2. **抗体偶联与LFIA组装**：将单克隆抗PVS抗体mAb2通过物理吸附偶联至UR@APTES@AuNPs表面，制备免疫探针。LFIA试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜和吸水垫层压在聚氯乙烯（polyvinyl chloride, PVC）背板上构成，mAb1和抗小鼠IgG分别喷印于NC膜上形成检测线（T线）和质控线（C线）。
3. **检测与信号读出**：待测样品通过毛细作用迁移，PVS与探针上mAb2结合后，被T线处固定的mAb1捕获，形成可见红色条带（比色信号），在365 nm手持紫外灯激发下呈现荧光信号（荧光模式），使用手机相机拍摄并用Image J软件量化信号强度。样本来源包括市售PVS标准品和田间采集的染毒马铃薯叶片（浙江省），叶片匀浆后离心过滤用于检测。
**研究结果**
**3.1 UR@APTES@AuNPs的表征**
通过场发射扫描电子显微镜（FESEM）和透射电子显微镜（TEM）观察，UiO-66呈规整八面体结构，平均边长150–200 nm，比表面积2043.54 m2/g（BET法）。RhB负载、APTES硅烷化和AuNPs包覆后，UiO-66的八面体形貌保持不变，且X射线衍射（XRD）显示晶型完整，无Au特征峰（因Au含量低且粒径小）。X射线光电子能谱（XPS）证实了Zr 3d、Si 2p、Cl 2p、N 1s和Au 4f的化学状态变化，表明成功构建了Si-O-Zr键和氨基功能化，并通过电负性差异实现AuNPs吸附。动态光散射（DLS）和Zeta电位监测显示，粒径从UR的298.11 nm增至UR@APTES@AuNPs的520.31 nm，Zeta电位从?25.8 mV（UiO-66）反转至+25.0 mV（UR@APTES）后降至?29.4 mV（AuNPs包覆后），证实了逐级组装。荧光光谱和紫外-可见吸收光谱进一步确认了RhB荧光保留及AuNPs包覆导致的光谱红移和强度衰减。
**3.2 实验参数优化**
通过单因素优化确定：RhB最佳浓度为1.0 mg/mL（避免聚集猝灭），APTES硅烷化时间1 h（获得最佳荧光间隔层），抗体mAb2最佳偶联浓度10 μg/mL（最高偶联效率），偶联pH为9（有效抗体-纳米颗粒结合），LFIA孵育时间15 min（荧光信号达平台）。这些条件确保了探针性能最优。
**3.3 基于UR@APTES@AuNPs的LFIA双信号PVS检测**
用市售PVS标准品（浓度通过ELISA标定为23119.2 pg/mL）经系列稀释后检测。在自然光下，比色信号随PVS浓度降低而减弱，肉眼可辨最低浓度为46.2 pg/mL；在365 nm紫外激发下，荧光信号可区分至23.1 pg/mL。经Image J量化T/C比值（T线与C线灰度值比值），比色模式下PVS浓度与T/C值呈线性关系（R2=0.980），LOD为31.2 pg/mL；荧光模式下线性关系更优（R2=0.995），LOD为7.6 pg/mL，均比传统AuNPs基LFIA（LOD=462.4 pg/mL）低一个数量级以上。探针在30天内粒径变化仅3.8%，荧光稳定性良好。
**3.4 特异性评价**
在PVX和PVY浓度为目标PVS十倍的情况下，比色和荧光模式下T线均无可见信号，而PVS组呈现清晰条带和强荧光。定量分析显示差异显著（p<0.001），证实该LFIA对PVS具有高特异性，不受常见干扰病毒影响。
**3.5 田间样品实际应用**
田间采集的PVS染毒马铃薯叶片经匀浆、离心、过滤后，以不同稀释倍数（1×、10×、100×、500×）检测。在比色和荧光模式下，信号强度随稀释倍数增加而递减，500倍稀释时荧光模式仍可清晰区分于阴性对照。两者均呈现良好线性剂量-响应关系，证明该平台可用于实际现场样品分析。
**讨论与结论**
讨论部分指出，UR@APTES@AuNPs探针通过内部RhB产生强荧光信号，外部AuNPs实现比色读出和简易抗体偶联，每个探针负载大量信号分子，显著增强信号强度。与现有基于多层核壳结构或酶/纳米酶放大策略的LFIA相比，该探针避免了复杂合成步骤或额外底物孵育，操作简便且重复性好。APTES硅烷层不仅作为间隔层抑制AuNPs对RhB的荧光共振能量转移（FRET）猝灭，还提供正氨基促进AuNPs吸附。研究采用T/C比值而非原始T线信号以减小试纸条间变异。尽管探针合成步骤较多，但通过进一步优化参数和标准化制备有望改善批间重现性。未来整合智能手机成像和机器学习可实现快速高精度定量检测。
结论部分翻译：
**结论**
研究人员开发了一种核壳结构纳米复合材料UR@APTES@AuNPs，并将其作为新型探针应用于LFIA，实现了PVS的高灵敏双模式检测。多孔UiO-66框架作为多功能载体，既能高效封装RhB用于荧光信号输出，又能负载AuNPs以支持抗体直接偶联和比色检测。该双信号平台通过比色读出具肉眼实现现场定性筛查，通过荧光模式在15分钟内完成定量分析。所开发的LFIA试纸条表现出高特异性，比色模式LOD为31.2 pg/mL，荧光模式LOD为7.6 pg/mL，相比传统AuNPs基LFIA（LOD=462.4 pg/mL）提升了一个数量级以上。通过在田间采集的染毒马铃薯叶片中成功检测PVS，进一步验证了该平台的实际应用价值。综上所述，所提出的双模式LFIA为PVS的高灵敏现场检测提供了一种经济高效、可部署的平台。此外，通过使用相应的特异性抗体，该平台可轻松适用于其他病原病毒的检测。
