多组学分析揭示发酵蛹虫草菌糠在蛋鸡中的潜力

《Frontiers in Microbiology》：Multi-omics analysis reveals the potential for fermented Cordyceps militaris mushroom substrate in laying hens

　　

本研究探讨了不同水平的发酵蛹虫草菌糠（CMMS）替代蛋鸡日粮对生产性能、消化健康、免疫、盲肠微生物群、代谢物及群体感应功能的影响。发酵降低了CMMS干物质、中性洗涤纤维（NDF）和磷含量（p<0.05）。用发酵CMMS替代30%日粮显著提高了产蛋率、蛋重、采食量和饲料效率（p<0.05），同时增强了蛋黄颜色、哈氏单位和脂肪酶活性。20%替代增加了养分消化率和免疫球蛋白水平（p<0.05）。宏基因组分析显示，Phocaeicola、Alistipes和Parabacteroides丰度增加（p<0.05），并增强了能量代谢和特定基因家族。代谢组学分析鉴定出1,529种差异表达代谢物，其中羧酸类最丰富（21.20%），并增强了牛磺酸/亚牛磺酸代谢和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定生物合成。Parabacteroides与某些代谢物呈负相关，而Alistipes与PemK/MazF家族基因呈正相关（p<0.001）。CMMS发酵饲料比例影响蛋鸡盲肠微生物群、其代谢物和群体感应，从而影响生产、消化率、免疫、代谢和健康，表明CMMS作为替代家禽营养的潜力。

家禽养殖是全球重要的食品生产系统，鸡的肠道微生物群落对宿主健康与生产性能具有关键影响。传统饲料资源短缺且价格持续上涨，促使研究人员探索非常规饲料原料。蛹虫草（Cordyceps militaris）作为一种食用药用真菌，其培养后的菌糠（CMMS）是高质量的可再生副产物，但能否作为蛋鸡饲料资源及其作用机制尚不清楚。为此，研究人员以144只18周龄海兰褐蛋鸡为对象，来自甘肃省临洮县佳源家禽养殖技术示范园，研究不同比例（0%、10%、20%、30%）发酵CMMS替代基础日粮后，对蛋鸡的生产性能、消化健康、免疫、盲肠微生物结构、代谢物及群体感应（QS）功能的影响。该研究发表于《Frontiers in Microbiology》，揭示了发酵CMMS作为替代家禽营养的潜力，为非常规饲料利用提供了理论依据。

研究人员主要采用以下关键技术方法：营养成分分析（酸不溶灰分法测定表观消化率）；生产性能、蛋品质、酶活性（脂酶、胰蛋白酶、α-淀粉酶ELISA试剂盒）及血清免疫球蛋白（IgA、IgM、IgG ELISA试剂盒）检测；宏基因组分析（DNA提取、建库、DNBSEQ-G400/T7/T10平台测序、MEGAHIT组装、MetaGeneMark基因预测、DIAMOND比对KEGG和Swiss-Prot数据库、Kraken LCA分类注释）；非靶向代谢组学（UPLC-Orbitrap-MS分析盲肠食糜、Progenesis QI处理、OPLS-DA模型筛选差异代谢物）；Spearman相关性分析评估微生物与代谢物及QS基因的关联。

**Changes in the nutritional components of fermented CMMS and production performance, egg quality, and physical and chemical indicators of laying hens**
通过营养成分分析发现，发酵使CMMS的干物质、中性洗涤纤维（NDF）和磷含量显著降低（p<0.05），而粗灰分和钙含量显著升高（p<0.05）。生产性能测定显示，30%替代组（DMC）的产蛋率、蛋重、日采食量和饲料转化比均显著优于其他组（p<0.05），且蛋黄颜色和哈氏单位显著提高（p<0.05）。20%替代组（CMC）的干物质、粗蛋白和NDF表观消化率显著高于其他组（p<0.05）。盲肠酶活性检测表明，DMC组脂肪酶活性显著升高（p<0.05），10%替代组（BMC）α-淀粉酶活性显著升高（p<0.05）。血清免疫球蛋白方面，CMC组IgA和IgM显著升高（p<0.05），BMC组IgG显著升高（p<0.05）。

**Changes in the bacterial community structure of the cecum of laying hens fed different proportions of CMMS**
宏基因组测序共获得158 Gb数据，经质控后得到10亿条读数，平均长度1482.62 bp。主坐标分析（PCoA）显示不同替代组鸡盲肠微生物群落结构存在显著差异。在门水平，优势菌群为拟杆菌门（Bacteroidota）和芽孢杆菌门（Bacillota），相对丰度均大于1%。与对照组相比，DMC和CMC组热脱硫杆菌门（Thermodesulfobacteriota）、螺旋体门（Spirochaetota）丰度显著增加（p<0.05）；BMC组未分类细菌门和支原体门（Mycoplasmatota）显著增加（p<0.05）；CMC组疣微菌门（Verrucomicrobiota）显著增加（p<0.05）。在属水平，DMC组Phocaeicola、Alistipes、Parabacteroides丰度显著升高（p<0.05），BMC和DMC组Bacteroides丰度显著升高（p<0.05），而AMC组Faecalibacterium和Pseudoflavonifractor丰度显著升高（p<0.05）。LEfSe分析识别出各组特征性生物标志物。KEGG通路富集分析显示，AMC组聚糖生物合成与代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢及复制修复通路增强；BMC组氨基酸代谢、碳水化合物代谢及复制修复通路增强；DMC组能量代谢和氨基酸代谢增强。

**Changes in QS genes of microbial communities in the cecum of laying hens fed different proportions of CMMS**
共注释到9个群体感应（QS）基因，按相对丰度排序为：LuxS家族、假尿苷合酶RluA家族、自诱导物调控转录调控蛋白家族、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶家族、自诱导物合酶家族、PemK/MazF家族、AgrB家族、自诱导物-2外排蛋白（AI-2E）家族和肽酶S45家族。Stamp差异分析表明，AMC组假尿苷合酶RluA家族、LuxS家族和自诱导物调控转录调控蛋白家族增加；BMC组假尿苷合酶RluA家族和LuxS家族增加；DMC组假尿苷合酶RluA家族增加。

**Changes in differential metabolites in laying hens fed different proportions of CMMS**
非靶向代谢组学共鉴定出1,529种差异表达代谢物，按类别占比排序：羧酸类及其衍生物（21.20%）、有机氧化合物（10.10%）、脂肪酰类（9.00%）、异戊烯醇脂类（8.80%）、类固醇和类固醇衍生物（6.00%）、苯及其取代衍生物（5.10%）、黄酮类（2.70%）、吲哚及其衍生物（2.40%）、甘油磷脂（1.90%）、酚类（1.80%）及其他（31.00%）。火山图分析显示，BMC_VS_AMC组有171个上调、125个下调代谢物；CMC_VS_AMC组308个上调、287个下调；DMC_VS_AMC组304个上调、334个下调。KEGG富集分析表明，BMC_VS_AMC组差异代谢物最显著富集于牛磺酸和亚牛磺酸代谢通路；CMC_VS_AMC组最显著富集于糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定生物合成；DMC_VS_AMC组最显著富集于自噬-其他通路。

**Interactions between microorganisms and differential metabolites and QS genes**
Spearman相关性分析显示，Alistipes与十二烷二酸、十四烷二酸呈显著负相关（r<0，p<0.001）；Bacteroides与十四烷二酸、rhizocticin A呈显著负相关（r<0，p<0.001）；Clostridium与十四烷二酸呈显著正相关（r>0，p<0.001）；Parabacteroides与十四烷二酸、癸二酸呈显著负相关（r<0，p<0.001）；Pseudoflavonifractor与rhizocticin A和1-氨基-3-(N-苯基苯胺基)尿素呈显著正相关（r>0，p<0.001）。在QS基因方面，Alistipes与PemK/MazF家族呈正相关（r>0，p<0.001），与AI-2E家族呈负相关（r<0，p<0.001）；Bacteroides与PemK/MazF家族正相关，与AI-2E负相关；Clostridium与PemK/MazF家族和自诱导物合酶家族负相关（r<0，p<0.001），与AI-2E家族和自诱导物调控转录调控蛋白家族正相关（r>0，p<0.001）；Faecalibacterium与肽酶S45家族负相关，与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶家族正相关（r>0，p<0.001）；Parabacteroides与AI-2E家族负相关，与自诱导物合酶家族正相关（r>0，p<0.001）；Phocaeicola与假尿苷合酶RluA家族、肽酶S45家族、自诱导物调控转录调控蛋白家族和AgrB家族负相关（r<0，p<0.001），与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶家族正相关（r>0，p<0.001）；Pseudoflavonifractor与假尿苷合酶RluA家族和PemK/MazF家族负相关（r<0，p<0.001）。

讨论部分指出，发酵CMMS改变了营养成分，提高了蛋鸡生产性能、蛋品质和消化率，并促进了消化酶活性和血清免疫球蛋白含量。宏基因组分析揭示了盲肠微生物群落以拟杆菌门和芽孢杆菌门为主，发酵CMMS促进了消化、代谢和免疫调节。QS基因分析表明，发酵CMMS可能通过LuxS家族调控AI-2介导的细菌群体感应，并通过假尿苷合酶RluA家族影响细菌生理状态和群体行为。代谢组学结果显示，羧酸类代谢物占主导，提示主要影响能量代谢和生物膜形成；有机氧化合物参与信号转导和抗氧化；KEGG富集分析进一步表明发酵CMMS影响抗氧化、胆汁酸结合、细胞稳态和免疫调节。微生物与代谢物及QS基因的关联分析初步揭示了Parabacteroides、Pseudoflavonifractor等菌属在能量代谢、脂质代谢和免疫功能中的潜在调控作用。

**Conclusion**
总之，本研究确定了不同浓度发酵蛹虫草菌糠替代日粮后蛋鸡的宏观和微观表现。研究表征了在此替代方案下蛋鸡的生产性能、表观消化率、微生物群落及其代谢物以及群体感应基因的变化。这些变化增强了蛋鸡的能量代谢并调节了免疫系统，为蛋鸡微生物组提供了见解，并为发酵蛹虫草菌糠在蛋鸡中的饲料利用提供了参考。