《Frontiers in Genetics》：Stereo-cell coupled with single-cell transcriptomics identifies a transitional metabolic state in maturing skeletal muscle myofibers
编辑推荐：
识别骨骼肌纤维类型和代谢重编程对于出生后肌肉成熟至关重要，但中期成熟过程中肌纤维的高分辨率代谢和空间异质性仍知之甚少。研究人员对来自5周龄小鼠的五块后肢肌肉进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核RNA测序（snRNA-seq），并结合单肌纤维分
识别骨骼肌纤维类型和代谢重编程对于出生后肌肉成熟至关重要，但中期成熟过程中肌纤维的高分辨率代谢和空间异质性仍知之甚少。研究人员对来自5周龄小鼠的五块后肢肌肉进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核RNA测序（snRNA-seq），并结合单肌纤维分辨率的立体细胞（Stereo-cell）技术，以阐明肌纤维亚型成熟及其代谢变化。通过整合scRNA-seq和snRNA-seq数据，研究人员构建了一个全面的小鼠骨骼肌细胞图谱，展示了两种技术在捕获间质细胞和多核肌纤维方面的互补优势。研究分析解析了一条从I型到IIB型肌核（IIB_1–3）的连续成熟谱系。值得注意的是，IIB_3肌核亚型表现出双重高代谢表型，即氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解活性均升高，这与成年小鼠中观察到的纯粹糖酵解表型不同。Stereo-cell进一步验证了这种过渡性代谢状态，并揭示了个体IIB肌纤维内的空间异质性，存在局部的高氧化区域。此外，研究人员观察到一种混合肌纤维表型，亚型特异性肌球蛋白重链表达富集于肌纤维末端，表明成熟过程中肌纤维的方向性转化。总之，本研究揭示了出生后肌肉成熟过程中IIB型肌纤维一种此前未描述的过渡性代谢特征，阐明了肌纤维的空间代谢异质性，为骨骼肌发育可塑性和代谢特化的调控机制提供了新见解。
**论文解读：基于单细胞和空间转录组学揭示中期成熟骨骼肌肌纤维的过渡性代谢状态**
**研究背景与问题**
骨骼肌是机体运动和能量代谢的核心效应器官，其功能高度依赖于肌纤维的细胞异质性。传统上，基于肌球蛋白重链（MyHC）亚型，哺乳动物肌纤维分为四种经典亚型：I型（慢速氧化型）、IIA型（快速氧化-糖酵解型）、IIX型（快速中间型）和IIB型（快速糖酵解型）。出生后肌肉成熟涉及肌纤维亚型特化、代谢重编程和收缩装置成熟的关键窗口期，约在3–7周龄。然而，现有研究多聚焦于成体完全成熟的肌纤维，对中期成熟（如5周龄）肌纤维的动态特征缺乏高分辨率解析。特别是IIB型肌纤维——丰度最高且功能关键的亚型——如何逐步建立成人代谢表型，以及氧化磷酸化和糖酵解通路在成熟过程中的时序切换，仍不清楚。此外，传统转录组学方法（如批量测序、scRNA-seq和snRNA-seq）在解析多核肌纤维内部空间异质性方面存在局限，无法揭示单肌纤维内的区域性代谢域或沿纤维轴的方向性亚型转换。因此，需要突破性技术来填补这一认知空白。
**研究目的、结论与意义**
研究人员以5周龄C57BL/6小鼠为模型，系统收集后肢比目鱼肌（SOL）、趾长伸肌（EDL）、胫骨前肌（TA）、腓肠肌（GAS）和股四头肌（QUAD），利用单细胞/单核转录组测序和立体细胞（Stereo-cell）空间转录组技术，构建了高分辨率肌纤维亚型图谱。通过伪时间分析和代谢通路特征评分，研究人员不仅精细描绘了从I型到IIA、IIX和IIB型肌纤维的成熟轨迹，还发现5周龄小鼠的IIB型肌纤维表现出氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解双重高活性的过渡性代谢表型，而非成体典型的纯糖酵解表型。更重要的是，通过Stereo-cell技术，研究人员实现了该过渡性代谢状态的原位验证，揭示了个体IIB型肌纤维内存在局部高氧化代谢区域以及富集于肌纤维末端的方向性亚型转换。这一发现为解析骨骼肌发育过程中代谢可塑性的动态调控提供了新视角。该论文发表在《Frontiers in Genetics》。
**主要关键技术方法**
研究采用以下主要技术方法：（1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核RNA测序（snRNA-seq），对5周龄雄性C57BL/6小鼠（共4只：1只用于scRNA-seq，1只用于snRNA-seq，2只用于Stereo-cell）的五块后肢肌肉（SOL、EDL、TA、GAS、QUAD）进行转录组分析；（2）立体细胞（Stereo-cell）空间转录组技术，基于高密度DNA纳米球（DNB）阵列，实现单肌纤维分辨率的原位转录本图谱；（3）伪时间分析（Monocle3）重建肌纤维分化轨迹；（4）代谢通路特征评分（AddModuleScore）量化糖酵解和氧化磷酸化活性；（5）RCTD（Robust Cell Type Decomposition）算法对空间转录组数据进行肌核亚型反卷积；（6）K-means聚类和DBSCAN密度聚类用于肌纤维区域分割和空间域识别。
**研究结果**
**1. 单细胞和单核RNA测序破译5周龄小鼠骨骼肌的细胞图谱特征**
通过对整合的scRNA-seq和snRNA-seq数据进行UMAP降维聚类，研究人员鉴定了多种骨骼肌固有细胞类型，包括肌肉卫星细胞（MuSC）、纤维/脂肪祖细胞（FAPs）、内皮细胞（EC）、淋巴内皮细胞（LEC）、平滑肌细胞（SMC）、免疫细胞、脂肪细胞、髓鞘施万细胞（mSchwann）、非髓鞘施万细胞（nmSchwann）、腱细胞、周细胞、I型肌纤维（MF_I）、II型肌纤维（MF_II）、神经肌肉接头细胞（NMJ）和肌腱连接细胞（MTJ）。细胞比例分析显示，scRNA-seq更易捕获内皮细胞、周细胞、MuSC等小细胞，而snRNA-seq更好捕获多核肌纤维及NMJ、MTJ，证实两种技术的互补优势。各肌组织细胞组成存在差异：I型肌纤维几乎仅分布于SOL，FAPs在GAS中比例较高。
**2. 小鼠骨骼肌肌纤维的单核转录组图谱和代谢异质性分析**
对肌纤维数据再聚类，UMAP分析将肌纤维分为从MF_I到MF_IIB（进一步分为MF_IIB_1、MF_IIB_2、MF_IIB_3）的连续亚型。MF_I高表达Tnnt1、Tnnc1和Myh7；MF_IIA高表达Myh2；MF_IIX高表达Myh1；MF_IIB高表达Myh4。GO富集分析显示，MF_I/IIA/IIX/IIB_1亚型富集肌肉发育和结构形成功能，而MF_IIB_3亚型独特富集氧化磷酸化通路，且其标志基因编码关键糖酵解酶（Ldha）。伪时间分析重建从I型到IIB型的分化轨迹，发现Ldha表达随伪时间递增，而氧化磷酸化相关基因Atp5b和Cox4i1先降后升，在MF_IIB_3达到峰值。代谢通路评分显示，所有肌组织中糖酵解从MF_I到MF_IIB_3逐渐增加；氧化代谢从MF_I到MF_IIB_1先降，随后回升至MF_IIB_3达最高，证实5周龄小鼠骨骼肌存在糖酵解和氧化代谢双高状态的肌纤维亚型。
**3. Stereo-cell揭示骨骼肌肌纤维亚型的动态转换**
通过胶原酶消化分离EDL和SOL的单肌纤维，结合Stereo-cell技术进行原位转录组分析。肌球蛋白重链亚型基因表达显示，EDL主要由MF_IIB肌纤维组成，Myh1（MF_IIX标志）在某些IIB纤维末端表达（6/19，31.6%），同时观察到完全缺乏Myh1表达（11/19，57.9%）或弥散表达（2/19，10.5%）模式，提示成熟过程中IIX到IIB转换的异质性。在SOL中，部分MF_I肌纤维末端表达Myh2（MF_IIA标志），表明I型到IIA型的转换。这些结果证实了5周龄小鼠骨骼肌中肌纤维亚型的动态转换和单肌纤维水平的分子异质性。
**4. Stereo-cell揭示IIB型肌纤维内的高氧化代谢区域**
利用Stereo-cell数据可视化糖酵解（Ldha）和氧化磷酸化（Cox4i1）基因表达，并进行特征评分。K-means聚类基于糖酵解和氧化磷酸化评分将肌纤维区域分为4个簇，识别出簇2为高氧化代谢区域，其氧化磷酸化评分显著高于其他簇。通过RCTD反卷积将单细胞肌核亚型映射到整根肌纤维，发现MF_IIB_3肌核具有最高反卷积得分且分布于几乎整个肌纤维；MF_IIB_2偏好定位于纤维末端或中央区域；MF_IIB_1则零星散布。各区域的代谢通路评分统计显示，MF_IIB_3区域的糖酵解和氧化磷酸化评分均显著高于MF_IIB_2（p < 0.05），验证了MF_IIB_3亚型的双高代谢状态，并揭示了IIB型肌纤维内的空间代谢异质性。
**讨论与结论**
讨论部分指出，传统观点认为IIB型肌纤维是糖酵解代谢的原型，线粒体含量极低。然而，本研究通过5周龄小鼠单核转录组分析发现，MF_IIB_3肌核亚型在关键成熟窗口期表现出糖酵解和氧化磷酸化基因的双高表达特征，填补了骨骼肌发育代谢重塑的时间空白。研究人员推测，5周龄作为小鼠从幼年到成体的关键过渡期，代表了从早期氧化代谢向成体代谢表型转换的“重叠阶段”，代谢特征建立可能是一个连续渐进的重塑过程。此外，Stereo-cell技术首次在单肌纤维分辨率下观察到IIB型纤维内部存在“高氧化代谢区域”，表明肌纤维内存在“肌核特化域”，特定肌核局部调控周围细胞质成分以满足不同生理需求。同时，肌纤维末端的亚型特异性肌球蛋白重链表达模式提示肌纤维亚型转换具有方向性，可能从近肌腱连接处（MTJ）向中央区域推进。
研究结论（翻译自Discussion末段）：本研究通过整合单细胞转录组学、单核转录组学和Stereo-cell，构建了一个多维度的骨骼肌细胞异质性分析框架。scRNA-seq捕获丰富的间质微环境成分，snRNA-seq解决大而多核肌纤维的解离难题，Stereo-cell在单肌纤维分辨率下恢复了转录物的空间逻辑。这种从“单细胞/单核”到“原位空间分辨率”的递进研究策略，不仅精确捕捉了5周龄小鼠骨骼肌的中间发育状态，还为未来研究肌肉发育和再生中的细胞间相互作用提供了可参考的技术路径。研究揭示的IIB型肌纤维过渡性双高代谢表型和空间代谢异质性，为理解骨骼肌发育可塑性和代谢特化的调控机制提供了新见解。但本研究也存在局限性：各转录组学方法应用于有限小鼠数量（每项技术仅1-2只），未来需更大样本量验证；转录水平富集不直接反映代谢通路通量或酶活性；Stereo-cell获得的完整肌纤维数量有限（EDL n=19，SOL IIB纤维仅1根），需更大规模研究确立统计稳健性。
