芍麻止痉颗粒通过调控 cAMP/PI3K/AKT/NF-κB 信号通路、T细胞分化、小胶质细胞及肠道微生物群缓解抽动秽语综合征

《Frontiers in Physiology》：Shao-Ma-Zhi-Jing granules alleviate Tourette Syndrome by modulating the cAMP/PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway, T cell differentiation, microglia, and gut microbiota

　　

摘要：引言：芍麻止痉颗粒（SMZJ）已用于抽动秽语综合征（TS）的临床治疗。本研究旨在探讨 SMZJ 对 3,3’-亚氨基二丙腈（IDPN）诱导的 TS 大鼠模型免疫系统及肠道微生物群的调节作用。方法：采用流式细胞术、蛋白质印迹法（Western blotting）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测免疫相关指标。通过 16S rDNA 测序分析肠道微生物群组成，并采用 Spearman 分析评估肠道微生物群与免疫功能之间的相关性。结果：SMZJ 抑制了 IDPN 诱导的刻板行为。此外，SMZJ 调节了辅助性 T 细胞 1（Th1）、Th2、Th17 和调节性 T 细胞（Treg）相关转录因子的 mRNA 和蛋白水平，并调控了 TS 大鼠模型中的 Th1 与 Th2 细胞因子。SMZJ 下调了 TS 大鼠模型脑纹状体中的炎症通路，以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）水平，并降低了纹状体诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平。SMZJ 处理重塑了 TS 大鼠模型肠道微生物群的多样性与结构。SMZJ 还调节了免疫参数与肠道微生物群之间的相关性。结论：SMZJ 通过促进 T 细胞分化并下调 TNF-α 和 IL-6 水平，减轻了 TS 大鼠的外周炎症和神经炎症，这可能与 cAMP/PI3K/Akt/NF-κB 信号通路的变化有关。SMZJ 下调了 TS 模型纹状体 M1 型小胶质细胞的活化。SMZJ 还可能通过调节肠道微生物群结构与代谢，缓解外周炎症和神经炎症，并改善肠黏膜屏障损伤。

《Frontiers in Physiology》发表的这项研究围绕抽动秽语综合征（TS）的免疫异常、神经炎症与肠道微生物群失衡展开。TS 是一种复杂的神经发育性疾病，以运动性抽动、发声性抽动或二者并存为主要特征。既往研究表明，其发生发展不仅与多巴胺（DA）能系统功能紊乱相关，也与外周免疫失衡、脑内小胶质细胞活化以及肠—脑轴异常密切相关。尤其在 TS 患者中，T 细胞亚群比例异常、促炎细胞因子升高以及肠道菌群结构改变已逐渐成为病理机制研究的重要方向。然而，临床用于治疗 TS 的芍麻止痉颗粒（SMZJ）虽已显示较好疗效和安全性，但其是否通过调控免疫系统与肠道微生物群发挥作用，仍缺乏系统研究。因此，研究人员以 3,3’-亚氨基二丙腈（IDPN）诱导的 TS 大鼠模型为基础，系统考察 SMZJ 对行为学、外周免疫、脑内炎症通路、小胶质细胞状态以及肠道微生物群结构和功能的影响，并进一步分析菌群与免疫指标之间的相关性。

在技术方法方面，研究采用雄性 Sprague Dawley 大鼠建立 IDPN 诱导的 TS 模型，并设置对照组、模型组、氟哌啶醇组及 SMZJ 低、高剂量组。通过行为学评分和 5 min 内抬头、转圈频次评估抽动样刻板行为；采用流式细胞术检测外周血 CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T 细胞比例；以蛋白质印迹法、qRT-PCR 和 ELISA 检测脾脏 T 细胞分化相关转录因子、纹状体炎症信号蛋白及血清细胞因子；采集盲肠内容物进行 16S rRNA 测序，并结合 LEfSe、PICRUSt2 和 Spearman 相关分析评估菌群组成、潜在代谢功能及其与免疫指标的关系。

在研究结果部分，论文首先在“3.1 SMZJ alleviated IDPN-induced stereotypical behaviors”中表明，IDPN 可稳定诱导大鼠出现明显刻板行为，而 SMZJ 尤其是高剂量干预能显著降低行为评分，并减少抬头等典型刻板动作频次，提示其对 TS 样行为具有明确缓解作用。

在“3.2 SMZJ exerted protective effects on the thymus and spleen in the IDPN-induced TS rat model”中，研究人员发现模型组胸腺指数和脾指数显著下降，说明 IDPN 诱导状态伴随免疫器官功能受损。SMZJ 干预后两项指标均升高，提示其对胸腺和脾脏具有保护作用，并可能改善整体免疫功能。

在“3.3 SMZJ regulated the levels of CD3⁺, CD4⁺, and CD8⁺ T cells”中，流式细胞术显示模型组 CD3⁺、CD4⁺ T 细胞比例及 CD4⁺/CD8⁺ 比值下降，而 CD8⁺ T 细胞比例升高，呈现与 TS 临床报道一致的 T 细胞亚群失衡。高剂量 SMZJ 可逆转这些变化，提示其促进 T 细胞分化并纠正外周免疫紊乱。

在“3.4 SMZJ regulated the transcription factors in splenic T helper 1 (Th1), Th2, T regulatory (Treg), and Th17 cells and improved the Th1/Th2 balance”中，研究从蛋白和 mRNA 两个层面考察脾脏 CD4⁺ T 细胞分化。模型组 Th1 相关转录因子 T-bet 增高，Th2 相关 GATA-3、Treg 相关 FOXP3 及 Th17 相关 RORγt 降低，T-bet/GATA-3 比值升高，提示 Th1/Th2 失衡偏向促炎状态。SMZJ 可下调 T-bet 及其与 GATA-3 的比值，并上调 Gata-3、Foxp3 和 Rorγt 的 mRNA 水平，同时提高 IL-4 水平并降低 IFN-γ/IL-4 比值，说明其可改善 Th1/Th2 细胞因子平衡，并对 Treg、Th17 相关分化网络具有调节作用。

在“3.5 SMZJ downregulated the cAMP/PI3K/NF-κB inflammatory signaling pathway in the brain striatum”中，研究人员检测脑纹状体 cAMP、PI3K、AKT、p-AKT、p-P65 和 P65 等蛋白。模型组 cAMP/PI3K/Akt/NF-κB 通路被显著激活，而高剂量 SMZJ 可降低 cAMP、PI3K、p-AKT、p-P65 水平及 p-AKT/AKT 比值，表明其可抑制纹状体内与炎症放大相关的关键信号转导过程。

在“3.6 SMZJ downregulated inflammatory cytokines in the TS rat model”中，ELISA 结果显示模型组血清 IL-6 和 TNF-α 水平升高，提示存在显著外周炎症反应。SMZJ 尤其显著降低 IL-6 水平，并使 TNF-α 呈下降趋势，支持其具备抗炎调节作用。

在“3.7 SMZJ promotes microglial activation in the rat brain striatum”中，尽管原标题措辞如此，实际结果显示 SMZJ 抑制而非促进小胶质细胞相关炎症表型。模型组纹状体 Iba-1 和 iNOS 升高，提示小胶质细胞活化及 M1 型极化增强；SMZJ 可显著降低 iNOS，并使 Iba-1 呈下降趋势，说明其能够抑制纹状体 M1 型小胶质细胞活化，从而缓解神经炎症。

在“3.8 SMZJ increased the diversity of gut microbiota and regulated community composition”中，16S rRNA 测序显示，各组 α 多样性指标差异不显著，但 β 多样性分析中对照组、模型组与 SMZJ 组的菌群结构明显分离，提示 TS 模型主要表现为菌群结构而非丰富度的重塑。属水平分析显示，模型组 Lactobacillus、Blautia、Dorea、Allobaculum、Bifidobacterium、Bacteroides 等菌属减少，而 Oscillospira、Ruminococcus、Adlercreutzia 和 [Ruminococcus] 增多；SMZJ 能使这些变化向对照状态回调。LEfSe 分析进一步筛选出 21 个差异标志菌，提示 SMZJ 对关键菌群具有重塑作用，尤其涉及部分短链脂肪酸（SCFAs，短链脂肪酸）相关菌群和潜在致炎菌群。

在“3.9 SMZJ improved microbial metabolism and function based on PICRUSt2 prediction”中，研究基于 PICRUSt2 对菌群潜在功能进行预测。结果显示，模型组糖鞘脂生物合成-乳糖和新乳糖系列等代谢通路受抑，乙苯降解和多环芳烃降解等通路上调；SMZJ 干预后可上调糖鞘脂生物合成-乳糖和新乳糖系列通路，并改善 chorismate biosynthesis II (archaea)、superpathway of ornithine degradation 和 androstenedione degradation 等 MetaCyc 通路异常，提示其可能通过修复菌群代谢潜能参与 TS 改善。

在“3.10 Analysis of the correlation between immune features and gut microbiota”中，Spearman 相关分析显示，炎症通路蛋白、炎症细胞因子、Th1 转录因子及纹状体指标与 Blautia、Faecalibacterium、Collinsella、Butyricoccus 丰度呈负相关，而与 Staphylococcus、Aggregatibacter 呈正相关；相反，Th2、Th17、Treg 相关指标与前述益生相关菌群呈正相关，与后述潜在致炎菌群呈负相关。这提示肠道微生物群变化与免疫失衡、神经炎症之间存在紧密联系。

讨论部分的核心在于将行为学改善、免疫调节、神经炎症抑制和菌群重塑整合为一个相互联系的病理调控框架。研究认为，TS 模型不仅表现为刻板行为和多巴胺相关异常，还伴随外周 T 细胞亚群紊乱、Th1/Th2 平衡偏移、促炎细胞因子升高及纹状体内 cAMP/PI3K/Akt/NF-κB 通路激活。SMZJ 可同时作用于这些环节：一方面通过促进 T 细胞分化、改善 Th1/Th2 失衡和降低 TNF-α、IL-6，减轻外周炎症；另一方面通过抑制 NF-κB 相关炎症信号与 iNOS 表达，抑制 M1 型小胶质细胞活化，减轻中枢神经系统（CNS）神经炎症。与此同时，SMZJ 还可重塑肠道菌群结构，提升与抗炎、肠屏障保护相关菌群的丰度，降低潜在致炎菌群丰度，并改善若干与神经免疫和代谢相关的微生物功能通路。论文也明确指出，当前证据主要反映相关性，尚未通过粪菌移植、抗生素清除或无菌动物模型建立严格的因果关系。

研究结论部分可译为：本研究表明，SMZJ 能显著缓解 TS 大鼠模型的症状。SMZJ 抑制了 TS 大鼠模型的外周炎症和神经炎症。SMZJ 通过促进 T 细胞分化并下调 TNF-α 和 IL-6 水平，减轻 TS 大鼠的外周炎症和神经炎症，这一作用可能与 cAMP/PI3K/Akt/NF-κB 信号通路的变化有关。SMZJ 下调了 TS 模型纹状体 M1 型小胶质细胞的活化。SMZJ 还可能通过调节肠道微生物群结构和代谢，缓解外周炎症和神经炎症，并改善肠黏膜屏障损伤。

总体而言，这项研究从免疫—脑—肠轴的整合视角，为芍麻止痉颗粒治疗 TS 提供了较为系统的实验依据，提示其不仅能够改善抽动样行为，还可通过调控 T 细胞分化、抑制纹状体炎症信号与小胶质细胞活化、并重塑肠道微生物群及其代谢功能，发挥多层级协同干预作用。这一结果为传统中药复方在 TS 干预中的现代机制阐释提供了重要支撑。