用于诱导结直肠癌细胞凋亡的槲皮素负载橙油纳米乳的低能耗自发制备

《BMC Complementary Medicine and Therapies》：Low-energy spontaneous fabrication of quercetin-loaded orange oil nanoemulsion for induction of colorectal cancer cell apoptosis

　　

背景：植物化学物（phytochemicals）显示出作为抗癌剂的潜在应用价值。本研究考察了槲皮素、冷压橙皮油及其混合物在天然状态、胶束分散体以及纳米乳中的作用，评价其诱导HCT116和Caco-2结直肠癌细胞发生凋亡的活性。

材料与方法：采用气相色谱分析对橙油组成进行表征。研究人员构建了不同的增溶体系，以将这些植物化学物整合入一种自乳化浓缩物中，该浓缩物在滴定入水后可自发形成胶束分散体和纳米乳。随后对纳米乳进行了多项表征评估，并开展了包括细胞毒性、细胞凋亡、蛋白表达及活性氧（ROS）在内的生物学评价。

结果：气相色谱分析显示，d-柠檬烯是橙油中的主要成分，占89%。由单一表面活性剂组成的体系以及由两种表面活性剂与助表面活性剂组成的体系，均能够在100 mL纳米乳中包载500 mg槲皮素和5%橙油。根据所包载植物化学物的不同，纳米乳粒径介于12 ± 0.09 nm至27 ± 0.1 nm之间，zeta电位约为?0.9 mV。槲皮素和橙油的包封效率均> 93%，且两者自制剂中的释放均呈现受控的时间依赖性特征。天然状态下的槲皮素和橙油对所检测结直肠癌细胞均表现出细胞毒性和促凋亡活性，而将二者联合后该效应进一步增强。与未经制剂化的天然状态相比，这些植物化学物的胶束分散体和纳米乳形式表现出更强的细胞毒性、促凋亡活性和ROS水平，提示纳米颗粒具有显著增强效应。此外，与采用单一表面活性剂制备的纳米乳相比，由两种表面活性剂混合制备的纳米乳通过下调CDC25A、PI3k和Bcl-2表达水平并上调Bax表达，表现出最佳的细胞毒性和晚期凋亡活性。

结论：将槲皮素与橙油共同构建为纳米乳，可视为一种有前景的制剂形式，未来可作为方案规定药物的辅助制剂加以考察，以增强其对结直肠癌细胞的作用。

该论文发表于《BMC Complementary Medicine and Therapies》，围绕天然植物化学物在结直肠癌干预中的递送瓶颈与增效策略展开研究。研究背景在于，结直肠癌是全球高致死性恶性肿瘤之一，尽管槲皮素等天然多酚类成分已被证实具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡和调控生长信号通路的潜力，但其极低的水溶性与有限的口服生物利用度，严重限制了临床转化。与此同时，冷压橙皮油中富含d-柠檬烯，已有研究提示其对结直肠癌细胞具有抗增殖和促凋亡活性，但挥发性精油的水分散稳定性较差，亦不利于在水性环境中应用。因此，如何构建一种既能高效包载槲皮素、又能稳定引入橙油并实现联合增效的水基递送体系，是该研究要解决的核心问题。基于这一需求，研究人员设计了一种低能耗自发乳化策略，将槲皮素与冷压橙皮油共同制备为纳米乳，旨在提高二者在结直肠癌细胞中的递送效率，并系统评价其对细胞增殖抑制、细胞凋亡、活性氧（ROS）调节以及凋亡相关蛋白表达的影响。

研究人员首先从制剂学角度建立适用于槲皮素与橙油共载的自乳化浓缩体系。研究显示，初始较低比例表面活性剂与助表面活性剂不足以维持槲皮素在水性胶束分散体系中的稳定存在，因此通过优化表面活性剂至10%、丙二醇（PG）至2%，实现了透明、均一的胶束分散体和纳米乳形成。气相色谱结果证实，所用冷压橙皮油中d-柠檬烯含量高达89%，为其主要活性组成。进一步表征显示，各纳米制剂粒径均处于纳米范围内，约为12–27 nm，分布较窄，zeta电位接近?0.9 mV，提示该体系主要依赖非离子表面活性剂产生的空间位阻稳定作用而非电荷排斥维持分散稳定。透射电子显微镜（TEM）观察表明颗粒呈球形且分布均一。所有制剂对槲皮素和橙油的包封效率均高于93%，并在24 h内表现出受控、时间依赖性的释放行为，说明该体系兼具高负载与缓释特征。

就研究方法而言，作者主要采用以下关键技术路径：首先利用气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）对冷压橙皮油成分进行定性定量分析；随后基于低能耗自发乳化技术构建槲皮素胶束分散体、橙油纳米乳及槲皮素-橙油共载纳米乳，并通过动态光散射（DLS）、zeta电位测定、透射电子显微镜（TEM）、包封效率测定和体外释放实验完成理化表征。生物学部分采用来源于ATCC的HCT116和Caco-2人结直肠癌细胞系，结合MTT法评价细胞毒性，流式细胞术分析凋亡/坏死分布，并检测NO、NOS2以及PI3k、CDC25A、Bax、Bcl-2等指标以阐释作用机制。

在结果部分，论文主体首先通过“Fabrication and characterization of the micellar dispersion, nanoemulsions and pure orange oil”说明制剂构建与理化性质。该部分显示，5%表面活性剂和1% PG不足以稳定包载500 mg槲皮素，滴定入水后立即析出；经优化后，10%表面活性剂和2% PG可形成稳定透明体系。F1与F2槲皮素胶束分散体粒径分别约为14 ± 0.02 nm和12 ± 0.09 nm，但含混合表面活性剂的F2在1周后出现槲皮素析出，而单一表面活性剂体系F1短期稳定性更佳。橙油纳米乳F3与F4则在30 d室温储存及37 ℃、24 h条件下均保持稳定，无明显油相分离；共载纳米乳F5与F6同样稳定，并保持黄色外观。TEM证实F4与F6颗粒呈球形、均一分布。该部分还表明，加入1%葵花籽油作为Ostwald熟化抑制剂，有助于改善以d-柠檬烯为主的橙油纳米乳稳定性。

在“Encapsulation Efficiency (EE%)”中，研究人员证明所有制剂在制备后即具有较高包封效率。槲皮素负载制剂F1、F2、F5、F6的包封效率为93.27%–97.5%，其中F2最高；橙油负载制剂F3、F4、F5、F6中，F6达到最高包封效率98.41%。这一结果说明该自发乳化体系能够有效包埋多酚类化合物与挥发性精油，为后续生物学作用提供稳定载体基础。

在“In vitro release study”中，研究显示所有制剂均呈现受控释药模式。24 h时，槲皮素释放率在73.96%–94.93%之间，橙油释放率在74.37%–89.25%之间，其中F6对槲皮素和橙油均表现出最高释放水平。这说明双表面活性剂共载纳米乳不仅包封效率高，还可在时程上提供更优释放表现。

在“Biological evaluations of micellar dispersions and nanoemulsions against colorectal cancer cells”部分，首先通过“Cytotoxicity evaluation of the unformulated quercetin and orange oil”说明未经制剂化的槲皮素、橙油及其混合物本身即具有抗结直肠癌活性。于100 μg/mL时，三者均可抑制HCT116和Caco-2细胞增殖，且联合组C3的抑制作用最强，提示槲皮素与橙油在天然状态下已表现出协同趋势。

随后在“Cytotoxicity evaluation of quercetin and orange oil formulated in nanoemulsions”中，研究人员比较了制剂化与未制剂化状态的差异。结果明确显示，所有制剂组F1–F6对两种细胞的抑制作用均强于相应DMSO对照组C1–C3；采用混合表面活性剂制备的F2、F4、F6普遍优于单表面活性剂制备的对应制剂；Caco-2细胞对纳米乳处理更敏感，尤其F6可将其增殖几乎降至零。该结果说明纳米递送显著增强了植物化学物的抗肿瘤效应，而共载策略与混合表面活性剂设计进一步放大了这种效应。

在“Cytotoxicity evaluation in terms of IC₅₀”中，IC₅₀定量结果进一步支持上述结论。最低IC₅₀值出现在F6处理Caco-2细胞时，为13.272 μg/mL，表明其为全研究中抗癌活性最强的制剂。由此可见，槲皮素与橙油共载、且采用双表面活性剂构建的纳米乳，是该研究筛选出的最优体系。

在“Apoptotic evaluation using flow cytometric analysis”中，作者分别分析了HCT116与Caco-2细胞的凋亡分布。针对HCT116细胞，F2、F4、F6均降低了Annexin V阴性/PI阴性的存活细胞比例，其中F6作用最显著。更重要的是，F6大幅提高晚期凋亡细胞比例至86.6%，同时保持较低坏死比例，提示其主要通过程序性细胞死亡而非非特异性细胞破坏发挥作用。针对Caco-2细胞，F6同样表现出最强促凋亡效应，晚期凋亡比例达93.3%，坏死比例仅1.24%。这些结果共同证明，共载纳米乳能够更加有效地驱动结直肠癌细胞进入凋亡程序。

在“Evaluation of reactive oxygen species”中，研究人员检测了NO与NOS2两个ROS相关指标。结果显示，未制剂化槲皮素（C1）可显著提高两种癌细胞中的NO与NOS2水平，其胶束制剂F2则进一步放大该效应；未制剂化橙油（C2）对NO和NOS2影响不显著或呈下降趋势，而其纳米乳F4仍表现为降低；共载混合物C3可升高NO与NOS2，而F6则进一步显著增强这种升高。尤其在Caco-2细胞中，这种变化更为明显。该结果提示，共载纳米乳诱导凋亡的过程可能与ROS相关信号增强有关。

在“Protein expression of PI3k, CDC25A, Bax and Bcl-2”中，论文从分子层面解释了促凋亡机制。所有处理均可下调PI3k与CDC25A表达，其中F6在Caco-2细胞中的抑制最强；与此同时，F6显著上调促凋亡蛋白Bax并下调抗凋亡蛋白Bcl-2。Bax/Bcl-2比值分析进一步表明，所有处理组比值均大于1.0，提示均具有诱导凋亡倾向，而F6在HCT116和Caco-2中的比值分别达12.96和26.87，为全部处理中最高。由此可见，该纳米乳通过抑制存活与细胞周期相关信号、激活线粒体途径相关促凋亡信号，形成了明确的分子作用模式。

讨论部分重点围绕制剂优化依据、稳定性机制以及抗癌机制展开。首先，作者指出，槲皮素的低水溶性决定了初始处方难以在滴定后维持稳定纳米分散，增加表面活性剂和PG比例是实现完全包载的关键。其次，橙油纳米乳之所以能够在低zeta电位条件下维持稳定，主要依赖非离子表面活性剂提供的空间位阻效应，以及葵花籽油对Ostwald熟化的抑制。再次，研究者强调，纳米乳强化抗癌活性的原因不仅在于改善了疏水性活性成分的水分散性，也在于纳米尺度颗粒更有利于与癌细胞相互作用和内吞摄取。最后，讨论将细胞毒性、凋亡、ROS变化及PI3k/CDC25A/Bax/Bcl-2表达结果整合起来，表明该体系对结直肠癌细胞的杀伤主要表现为促进程序性凋亡，并伴随关键存活信号通路下调与促凋亡分子上调。

研究结论部分可译为：结直肠癌仍需持续开展研究，以开发更有效地促使恶性细胞走向凋亡的药物或经典药物辅助制剂。本研究采用天然植物化学物组合策略，将槲皮素与冷压橙皮油混合并制备成专门设计的水基纳米乳。与单一表面活性剂制备的纳米乳相比，由两种表面活性剂构建的纳米乳通过下调CDC25A、PI3k和Bcl-2表达水平并上调Bax表达，表现出更优的细胞毒性和促凋亡活性。本文所述制备技术操作简便，具有向工业规模放大的实际可行性与经济可行性。