SEMA6A通过阻断ISG15/TGFβ轴抑制结直肠癌肿瘤进展并增强抗肿瘤免疫

《Molecular Biomedicine》：SEMA6A inhibits tumor progression and boosts anti-tumor immunity via blocking the ISG15/TGFβ axis in colorectal cancer

　　

摘要：Semaphorin（SEMA，信号素）家族为一类多样的膜相关蛋白，其失调与多种癌症相关，可影响肿瘤进展及免疫反应，但SEMA家族在结直肠癌（colorectal cancer, CRC）中的作用尚不清楚。研究人员发现Semaphorin 6A（SEMA6A）在CRC组织中表达下调，低SEMA6A表达与肿瘤侵袭性增加及患者不良预后相关。功能实验显示SEMA6A过表达在体外及体内均发挥抑瘤作用；整合RNA测序（RNA-seq）与蛋白质组学分析确定ISG15为受SEMA6A负调控的关键下游效应分子。机制上，SEMA6A抑制JAK-STAT3通路，导致ISG15表达降低，进而取消ISGylation（ISG15共价修饰）依赖的TGF-β1（transforming growth factor-beta 1）稳定作用并促进其降解，该过程经分子对接、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）及放线环己酰亚胺追踪（cycloheximide chase assay）验证。体外共培养及体内实验表明，肿瘤细胞SEMA6A过表达通过阻断ISG15/TGFβ轴增强CD8+T细胞毒性。生物信息学分析显示SEMA6A高且ISG15低表达的CRC患者免疫治疗效果更好。重要的是，SEMA6A过表达重塑肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），增强CD8+T细胞抗肿瘤免疫并抑制免疫逃逸，从而在体内增敏抗PD-1（anti-PD-1）免疫治疗。综上，SEMA6A可通过靶向ISG15/TGF-β1轴双重发挥作用——抑制CRC进展同时增强抗肿瘤免疫，是CRC潜在的预后指标及改善免疫治疗疗效、实现个体化治疗的靶点。

论文解读：SEMA6A通过阻断ISG15/TGF-β1轴抑制结直肠癌进展并增敏抗PD-1免疫治疗

研究背景与意义

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球癌症相关死亡的主要病因之一，多数患者确诊时已处于晚期，且大部分CRC患者对免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）如抗PD-1（anti-PD-1）治疗响应率低，亟需新的预后标志物与治疗靶点。Semaphorin（SEMA，信号素）家族成员在肿瘤发生及免疫调节中作用不一，SEMA6A同源分子SEMA6B在CRC中被报道促进免疫抑制微环境，但SEMA6A在CRC中的确切功能与机制尚不明晰。该研究发表于《Molecular Biomedicine》，研究人员旨在明确SEMA6A在CRC中的表达模式、预后价值及生物学功能，解析其调控下游效应分子ISG15及TGF-β1（transforming growth factor-beta 1）的分子机制，并评估SEMA6A过表达对抗PD-1免疫治疗的增敏作用，为CRC的预后判断与联合免疫治疗提供理论依据。

主要关键技术方法

研究人员采用NanoString技术检测CRC及癌旁正常组织的SEMA家族mRNA表达，结合GEO数据集（GSE44076、GSE17538、GSE29621等）及人CRC组织芯片（tissue microarray, TMA）免疫组化（immunohistochemistry, IHC）分析SEMA6A表达与临床病理及生存关系；通过转录组测序（RNA-seq）与蛋白质组学联合分析筛选SEMA6A调控的下游差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），利用CytoHubba插件锁定核心靶基因ISG15；构建SEMA6A过表达及敲低CRC细胞株，行CCK-8、EdU、伤口愈合、Transwell侵袭实验及上皮–间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）相关标记物检测；Western blot检测JAK-STAT通路磷酸化水平及ISGylation（ISG15共价修饰），分子对接预测ISG15与TGF-β1互作，Co-IP验证二者结合，放线环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）追踪检测TGF-β1蛋白稳定性；分离、活化小鼠CD8⁺T细胞与CRC细胞共培养，评估T细胞毒性因子分泌及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放杀伤率；建立C57BL/6J免疫健全小鼠及BALB/c nu裸鼠皮下成瘤模型评估体内抑瘤作用及CD8⁺T细胞浸润，并行抗PD-1单抗联合治疗实验，流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞活化与耗竭标志。

研究结果

SEMA6A is downregulated in CRC, suppresses malignancy, and predicts poor prognosis

NanoString与GEO数据分析显示SEMA6A mRNA在CRC组织中显著下调，TMA-IHC证实SEMA6A蛋白在癌组织中低于配对正常组织，低SEMA6A表达与总生存期（overall survival, OS）缩短、肿瘤体积大、N分期晚显著相关，是多变量Cox回归确定的独立预后因素，列线图具较高预测效能。体外实验中SEMA6A过表达显著降低CRC细胞增殖、迁移、侵袭能力并上调E-cadherin、下调Vimentin，抑制EMT；SEMA6A敲低则反之。表明SEMA6A在CRC中发挥抑癌作用并可作为预后指标。

Multi-omics identifies ISG15 as a downstream oncogenic target of SEMA6A in CRC

RNA-seq与蛋白质组学交集筛选出51个SEMA6A调控的潜在靶基因，其中ISG15在SEMA6A过表达组中mRNA及蛋白水平均显著下调，且在多个GEO数据集中与SEMA6A呈负相关；高ISG15表达关联不良OS，SEMA6A^highISG15^low患者预后最好。功能验证显示ISG15敲低抑制CRC细胞增殖、迁移、侵袭，逆转EMT，并下调免疫抑制因子mRNA。提示ISG15是SEMA6A负调控的促癌下游效应分子。

SEMA6A suppresses ISG15 expression via inhibiting STAT3 signaling in CRC

基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示JAK-STAT通路在对照细胞中富集，SEMA6A过表达降低STAT3 Tyr705磷酸化但不影响STAT1磷酸化；IL-6刺激可诱导p-STAT3及ISG15表达，该诱导作用在SEMA6A过表达细胞中被削弱，且SEMA6A特异性抑制IL-6诱导的ISG15上调而不影响ISG12、ISG20。回补ISG15可部分逆转SEMA6A过表达对CRC细胞恶性表型的抑制。证实SEMA6A经抑制JAK-STAT3信号下调ISG15表达。

In vivo experiments demonstrated the protective role of SEMA6A in CRC

皮下成瘤实验显示SEMA6A过表达减小C57BL/6J及BALB/c nu小鼠肿瘤体积与重量，免疫健全小鼠抑瘤率更高；早期（接种后第5天，肿瘤体积尚可比时）即见SEMA6A过表达组肿瘤内CD8⁺T细胞浸润增多，颗粒酶A（granzyme A, GZMA）、穿孔素1（perforin 1, PRF1）、IFN-γ上调；移植瘤IHC示PCNA及ISG15蛋白降低。说明SEMA6A既有肿瘤细胞自主性抑瘤作用，又通过增强CD8⁺T细胞免疫发挥额外抑瘤效果。

SEMA6A-ISG15 axis modulates CD8⁺T cell function

生物信息学分析显示SEMA6A^highISG15^lowCRC患者CD8⁺T细胞浸润最高，且该组合预测免疫治疗效果较好。共培养实验表明SEMA6A过表达CRC细胞使共培养CD8⁺T细胞毒性因子IFN-γ、颗粒酶B（granzyme B, GZMB）、PRF1分泌增加，LDH杀伤活性升高；ISG15过表达则抵消上述效应。证明SEMA6A-ISG15轴特异性调控CD8⁺T细胞效应功能。

ISG15 stabilizes TGF-β1 via ISGylation to promote CRC progression

TGFB1与SEMA6A负相关、与ISG15正相关；SEMA6A过表达或ISG15敲低降低TGF-β1 mRNA及上清分泌，ISG15过表达则升高。SEMA6A过表达降低全局ISGylation、ISG15及TGF-β1蛋白；分子对接提示ISG15与TGF-β1可能互作，IFN-β诱导ISGylation条件下Co-IP证实ISG15与TGF-β1物理结合；CHX追踪显示SEMA6A过表达加速TGF-β1降解，IFN-β预处理延长TGF-β1半衰期；外源添加TGF-β1可挽救SEMA6A过表达引起的增殖、迁移、侵袭抑制。表明ISG15通过ISGylation稳定TGF-β1蛋白促进CRC进展。

SEMA6A overexpression enhances the anti-tumor efficacy of PD-1 blockade in vivo

C57BL/6J皮下成瘤模型分组处理显示：单用抗PD-1抑瘤不显著，SEMA6A过表达单独抑瘤明显，二者联用抑瘤最强（肿瘤最小最轻）。联合组ISG15最低，免疫刺激因子CD86、LTA、CD27及细胞毒分子表达最高；IHC示SEMA6A过表达降ISG15、TGF-β1、PCNA，升CD8A、GZMA、PRF1、IFN-γ，加抗PD-1进一步降TGF-β1、PCNA并升GZMA、PRF1；流式示联合治疗增多肿瘤内CD8⁺T细胞，上调活化标志CD69、CD25，下调耗竭标志TIM-3、CTLA-4。证实SEMA6A过表达重塑免疫微环境并增敏抗PD-1治疗。

讨论与结论总结

讨论指出SEMA6A在CRC中低表达且为独立保护性预后因子；通过转录组–蛋白质组联合鉴定ISG15为其关键下游靶标，SEMA6A抑制JAK-STAT3通路降低ISG15转录，ISG15以ISGylation方式稳定TGF-β1使其免遭降解，SEMA6A阻断此轴减少TGF-β1分泌从而解除CD8⁺T细胞抑制，构成SEMA6A/STAT3/ISG15/TGF-β1新调控轴。SEMA6A在裸鼠中仍有抑瘤效果说明存在非免疫依赖性直接抑癌机制，而在免疫健全小鼠中抑瘤更强说明免疫激活是重要补充。SEMA6A过表达促进CD8⁺T细胞浸润、活化并降低耗竭，将"冷"肿瘤向"热"转化，联合抗PD-1产生协同抑瘤。研究局限含回顾性临床队列偏倚、未检测循环SEMA6A/ISG15、TGF-β1具体ISGylation赖氨酸位点未定、未探讨胞外ISG15对T细胞直接影响及需在基因工程小鼠中进一步验证。

结论翻译：综上，生物信息学与实验验证确定SEMA6A为CRC临床显著的保护性预后因素，高SEMA6A表达预示良好预后并增强免疫激活，是独立预后指标。功能上SEMA6A通过抑制STAT3/ISG15/TGF-β1轴抑制恶性肿瘤进展；通过阻断ISG15/TGF-β1轴增强CD8⁺T细胞毒性、提高其活化并减少耗竭。SEMA6A过表达在体内与抗PD-1阻断具协同作用，提高ICI敏感性。靶向SEMA6A/ISG15/TGF-β1轴可同时直接抑制CRC进展并增强抗肿瘤免疫，为CRC中联合SEMA6A调控与免疫治疗的双重策略提供依据。