论文解读文章

**研究背景与目的**
胃肠道线虫（GIN）感染仍是导致奶牛健康受损、生长和产奶效率下降的主要原因。尽管广谱抗蠕虫药已支撑寄生虫控制超过六十年，但其广泛使用在全球畜牧系统中驱动了耐药群体的选择。在小型反刍动物中，抗蠕虫药耐药性已广泛存在，而奶牛中温带地区的报告流行率较低，这可能源于常规用药方式（通常保留较高比例的未暴露群体），但也反映了方法学局限——例如温带地区以奥斯特他线虫（*Ostertagia ostertagi*）和库柏线虫（*Cooperia oncophora*）为主的奶牛粪卵计数（FEC）通常较低，且与真实虫荷关系不稳定。粪卵计数减少试验（FECRT）作为当前现场评估抗蠕虫药敏感性的标准，在奶牛中诊断敏感性降低。尽管挑战存在，耐药性报告日益增多，新西兰近期已确认奥斯特他线虫和库柏线虫对苯并咪唑类（BZ）、大环内酯类（ML）和左旋咪唑（LEV）的多药耐药性。英国的相关证据仍然有限。现有研究多涉及少数农场，难以形成有代表性的全国评估。有机生产系统因限制使用ML并强调最低限度用药，提供了独特视角。为填补知识空白，研究人员调查了苏格兰首个放牧季节（FGS）奶牛犊中抗蠕虫药耐药性的流行率。论文发表在《International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance》。

**主要关键技术方法（不超过250字）**
研究人员采用了三种核心技术方法：（1）**粪卵计数减少试验（FECRT）**，在4个非有机农场中，对犊牛分别给予芬苯达唑（FBZ）、伊维菌素（IVM）或莫昔克丁（MOX），并在治疗前（第0天）和治疗后第14天收集直肠粪便进行FEC分析，采用改良盐漂浮法（检测限1 epg），通过eggCounts和bayescount统计模型计算FECR和可信区间（CrI），并依据原始（Coles等，1992）和修订版（Kaplan等，2023）指南解读耐药性状态。（2）**卵孵化试验（EHT）**，在全部14个农场（包括10个有机农场）中，使用噻苯达唑（TBZ）进行剂量-反应曲线分析，计算EC50和EC95，并以农场3（敏感分离株）为参照计算耐药比率（RR），对孵出的幼虫/卵通过多重PCR进行物种鉴定。（3）**混合扩增子测序**，对7个农场的10个群体（包括FECRT治疗前后样本和有机农场自由采集样本）进行基因组DNA提取，扩增ITS-2、β-微管蛋白同种型1、β-微管蛋白同种型2和acr-8（后者仅针对*O. ostertagi*）四个位点，通过Illumina MiSeq平台进行250 bp双端测序，采用dada2进行扩增子序列变异（ASV）鉴定，利用Nemabiome工作流程分析物种组成，并定量BZ和LEV耐药相关等位基因频率。样本队列来源：14个苏格兰奶牛场（4个非有机，10个有机），其中10个有机农场约占苏格兰有机奶牛场的48%。

**研究结果**
**3.1 农场及其寄生虫管理**：14个农场的FGS犊牛群规模29–62头，4–7月龄。非有机农场过去7年仅使用ML类抗蠕虫药，有机农场仅使用BZ类。非有机农场平均每年进行两次群体治疗（主要为放牧中期和归牧时），有机农场6/10年均一次治疗，4/10不足一次。所有非有机农场采用预防性治疗方案，另有两个同时采用新抑制策略（长效MOX）。有机农场均采用基于FEC的“检测-治疗”方法，4/10还辅以预防性治疗。没有农场实施有效的检疫程序。

**3.2 非建模数据**：所有4个FECRT农场在用药后FEC均降低。治疗前数据呈过度离散。物种组成显示，6个物种（5属），治疗后O. ostertagi和C. oncophora成为仅存的两种。FBZ治疗后O. ostertagi比例增加，MOX治疗后C. oncophora比例增加。

**3.3 FECRT统计方法和指南的比较与解释**：采用eggCounts和bayescount模型，基于修订指南，两个模型在10/11次FECRT中一致（Cohen’s κ=0.656，实质性一致）。原始指南与修订指南在8/11次一致，但有3次被修订指南判为低耐药性而原始指南判为正常（κ=0.656）。针对插入物种的O. ostertagi群体，两个模型间一致；对C. oncophora群体，一致率达100%（κ=1）。原始与修订指南对O. ostertagi的判定仅为一般一致（κ=0.333），对C. oncophora则更低（κ=0.19）。

**3.4 卵孵化试验剂量-反应**：所有群体均获得足量卵，平均每孔207个卵，对照孔平均孵化率92.6%。O. ostertagi的EC50为0.017–0.157 μg/mL，EC95为0.045–1.293 μg/mL；C. oncophora的EC50为0.025–0.111 μg/mL，EC95为0.416–0.859 μg/mL。以农场3为敏感参照，O. ostertagi的RR为4.24–28.71，C. oncophora为1.70–12.87。

**3.5 扩增子测序**
**3.5.1 Nemabiome**：ITS-2代谢条形码鉴定出11个分类单元（96.3%至物种级）。最丰富物种为O. ostertagi和C. oncophora，出现在所有群体中。*Trichostrongylus axei*在每群均有，但ML治疗后消失。有机农场中出现了食道口线虫（*Oesophagostomum* spp.），两群检出*Haemonchus contortus*。BZ治疗后O. ostertagi比例从53.1%升至85.2%，C. oncophora从29.7%降至7.9%；ML治疗后O. ostertagi比例下降，C. oncophora上升。

**3.5.2 β-微管蛋白同种型1耐药相关多态性频率**：每群体产生4385–6211条序列读数。在7/10个群体中检测到BZ耐药等位基因。O. ostertagi中主要是F200Y（TTC→TAC），另有E198A和E198L；F167Y仅在有机农场8和14出现（低频1.3%和2.6%）。C. oncophora全部为F200Y，平均频率11.2%（范围2%–65.8%）。*Trichostrongylus* spp.中F200Y平均13.9%，E198L平均11.5%（1.1%–43.4%）。FBZ治疗后，所有强圆线虫总耐药等位基因频率从12.7%升至43.8%。未观察到EC值与等位基因频率的明确关联（R2<0.319）。

**3.5.3 β-微管蛋白同种型2和acr-8耐药相关多态性频率**：β-微管蛋白同种型2中未发现编码198和200位密码子的耐药等位基因。O. ostertagi的S167T（类似左旋咪唑耐药多态性S168T）仅在农场7检出，低频1.1%。acr-8位点观察到57个ASV，未发现已知LEV耐药等位基因。

**总结讨论**
该研究结果与全球抗蠕虫药耐药性上升趋势一致，证明苏格兰奶牛中多种线虫对三类主要抗蠕虫药存在耐药性。FECRT仍是关键现场检测，但不同统计方法和指南会导致同一数据的不同解释，原始指南可能低估耐药性流行率。为确定物种特异性耐药状态需多次FEC，但统计假设（如个体间物种比例一致等）带来挑战。Nemabiome分析揭示O. ostertagi和C. oncophora最为常见，并检出罕见物种。ML治疗后库柏线虫比例增加，可能因其临床致病性较低且生殖力高于O. ostertagi，导致FECRT敏感性有限。卵孵化试验显示大部分群体的EC值显著高于历史敏感分离株，提示存在耐药亚群。混合扩增子测序成功鉴定出BZ耐药等位基因，但EC值与等位基因频率间缺乏清晰关系，提示应作为互补指标而非互换指标。S167T在O. ostertagi中的检出为一新发现。研究结论部分翻译：本研究采用体内和体外试验，检验了英国用于治疗牛的主要化合物的抗蠕虫疗效，并突出了农场和强圆线虫物种间的疗效变异。它揭示了牛线虫对ML和BZ的新生耐药性，强调了统一诊断指南和可持续控制策略的必要性。治疗疗效的变异性以及不同统计方法和诊断标准对耐药性分类的影响显而易见。修订版FECRT指南在疗效约90%时使与以往研究的比较复杂化，突显了方法一致性的重要性。针对O. ostertagi和C. oncophora高于预期的EC值值得进一步研究，因为关于利用EHT解释和评估耐药性的经验数据和指导有限。对占苏格兰有机奶牛场48%的农场进行BZ疗效评估，增强了发现代表性。BZ耐药等位基因的变异频率（某些群体中相对读数丰度较高）值得关注，因为如果继续使用BZ产品治疗英国牛GIN感染，耐药性选择可能会增加。有机农场中高丰度的BZ耐药等位基因和高于预期的EC值令人担忧，因为这些农场几乎完全依赖此类药物，且被限制使用ML。因此，持续改进疗效检测以促进及时干预将非常有益。