综述：26S蛋白酶体的调控结构机制及其药理调控

《Journal of Biological Chemistry》：Structural mechanism of 26S proteasome regulation and its pharmacological modulation

　　

蛋白酶体是一种保守的蛋白水解机器，负责维持蛋白质质量控制并调控细胞活动的几乎所有方面。它是癌症中经过临床验证的治疗靶点，并且在蛋白质聚集相关疾病的治疗发现中具有巨大潜力。结构生物学的进展阐明了26S蛋白酶体的整体结构和构象动力学，为研究人员理解底物识别、解折叠、转运及蛋白水解过程，以及药理干预提供了机制层面的见解。这篇综述总结了当前关于26S蛋白酶体底物加工结构基础的研究进展，并重点阐述了由酶促辅助因子介导的新兴调控机制。研究人员概述了靶向蛋白酶体各组分的小分子抑制剂和激活剂的分子作用原理，以及直接涉及蛋白酶体的靶向降解策略。研究人员进一步探讨了辅助蛋白和小分子对蛋白酶体动力学及变构调控的新认知，将如何指导设计具有更广泛治疗应用的下一代蛋白酶体调节剂。

26S蛋白酶体调控结构机制及其药理调控研究综述

The regulatory particle

19S调节颗粒(RP)在蛋白酶体降解通路中发挥关键作用，负责识别多聚泛素化底物、移除泛素链并将蛋白质解折叠后递送至20S核心颗粒(CP)。RP的盖亚基复合体(lid)负责底物识别，基座亚基复合体(base)则是驱动底物解折叠与转运的核心引擎。盖亚基与基座的相互作用部分由RPN2介导，其连接RPT3和RPT6的N端卷曲螺旋区域，同时RPN5、RPN6和RPN7的四肽重复序列(TPR)结构域与RPT4、RPT3和RPT6的ATP酶结构域结合。盖亚基由非催化亚基(RPN3、RPN5、RPN6、RPN7、RPN8、RPN9、RPN12和SEM1)组装而成，作为支架支持多聚泛素链识别；基座亚基由RPN1、RPN10、RPN11、RPN13和六个ATP酶(RPT1-RPT6)组成，负责底物的解折叠与向CP内的转运。基座的AAA-ATP酶环通过ATP水解产生机械能，驱动底物解折叠并进入CP门控通道，该过程对受损、错误折叠或调控蛋白的选择性降解至关重要。RPN1、RPN10和RPN13作为泛素受体，主要识别并结合K48连接的泛素链及含泛素样(UBL)结构域的底物。RPN11是一种Zn²⁺依赖的去泛素化酶(DUB)，负责从底物上移除泛素链。六个AAA-ATP酶形成六聚体环，各亚基通过卷曲螺旋结构相互连接，形成直径约10 ?的中心通道，底物在ATP水解过程中通过该通道完成转运与解折叠。ATP水解产生的机械能驱动底物解折叠与门控开放，实现向CP的递送。除RPT4外，其余RPT亚基的C端尾部插入CP的α环，促进门控开放并增强底物结合。

RP还与多种调控其活性的辅助因子相互作用。穿梭因子如人源RAD23A/B及其酵母同源蛋白Rad23通过自身UBL结构域结合RPN10，促进底物降解。去泛素化酶如人源USP14(酵母同源物Ubp6)结合RPN1，并与ATP酶亚基RPT1、RPT2动态关联，从而在功能上解偶联ATP水解与RPN11介导的底物去泛素化；同时26S蛋白酶体的结合可显著增强Ubp6/USP14的DUB活性。UCH37同样通过C端KEKE基序被RPN13招募至蛋白酶体，移除底物上的泛素链并激活自身活性。E3连接酶包括UBE3C、E6AP和Parkin可与RP相互作用，调控26S蛋白酶体活性。此外，TXNL1通过其PITH结构域结合RPN11顶部，并接触RPN2和RPN10的VWA结构域，协助底物降解并可能利用其N端硫氧还蛋白(TRX)结构域还原二硫键。Midnolin是新发现的蛋白酶体互作辅助因子，通过C端螺旋结合RPN1，并通过N端UBL结构域结合RPN11，介导不依赖泛素的降解。锌指蛋白ZFAND5在肌肉萎缩过程中通过与RPT1、RPT5和RPN1相互作用促进蛋白质降解。Hsp70家族分子伴侣通过水解ATP重折叠错误折叠蛋白，防止蛋白聚集；其共伴侣Bag1通过UBL结构域结合RPN1，将Hsp70结合的底物递送至26S蛋白酶体，通过调控ATP酶构象动力学促进CP门控开放。除泛素化修饰外，FAT10ylation(FAT10修饰)作为一种泛素样修饰，也是蛋白酶体降解的特异性信号，含UBL和泛素结合(UBA)结构域的蛋白NUB1L介导FAT10修饰底物向26S蛋白酶体的招募。冷冻电镜研究显示FAT10包含两个串联的UBL结构域，NUB1通过结合RPN1的T2位点促进FAT10偶联底物向蛋白酶体的递送。

The core particle

CP是一个约700 kDa的多亚基复合物，由28个20-35 kDa的亚基组成，呈桶状四环结构，排列方式为α₇β₇β₇α₇，尺寸约为150×115 ?。无底物状态下，α环门控处于关闭状态；底物结合后诱导门控开放至直径约22 ?，允许底物进入蛋白水解腔室。α1-α7亚基无催化活性，形成调控底物进入的调节环。26S蛋白酶体的结构研究显示，相邻α亚基在CP门控周围的α环表面形成7个α口袋，其中5个结合RPT ATP酶的C端HbYX基序，触发CP门控开放。哺乳动物细胞中，PA700(19S)、PA28(11S)和PA200等多种CP激活剂通过与α口袋相互作用调控CP门控开放。合成HbYX基序肽也可结合α口袋刺激门控开放并增强20S蛋白水解活性。值得注意的是，PI31含有HbYX基序，但其固有的无序C端区域直接与催化位点相互作用，在不被降解的情况下抑制CP活性。

每个α环下方是由7个不同β亚基(β1-β7)组成的β环，环绕蛋白水解通道，内部通道直径约53 ?。催化亚基β1、β2和β5介导底物水解，三者虽结构排列相似但蛋白水解活性各异：β1具有半胱天冬酶样活性，β2具有胰蛋白酶样活性，β5具有糜蛋白酶样活性，共同将未折叠底物降解为肽段。β1、β2和β5属于N端亲核试剂(Ntn)水解酶家族，尽管序列同源性有限(约30%)，但共享保守的αββα折叠。催化机制中，N端苏氨酸残基Thr1作为亲核试剂，其γ-羟基攻击底物肽键的羰基碳，形成共价酰基-酶中间体，随后水解释放切割后的肽段并再生活性酶，完成肽键断裂。相比之下，β3、β4和β6缺乏必需的N端亲核残基，β7的保守催化位点发生取代，破坏了活性位点构型，因此无蛋白水解活性。

Substrate processing cycle of the 26S proteasome

由于RP具有内在的构象灵活性，研究人员采用冷冻电镜而非X射线晶体学解析了无底物26S蛋白酶体的高分辨率结构。早期底物结合的26S蛋白酶体高分辨率冷冻电镜结构揭示了底物结合与加工过程中的多个不同中间态，为研究人员理解蛋白酶体底物降解的分子机制提供了系统性见解。底物结合的蛋白酶体至少存在7种不同构象状态，命名为E_A1、E_A2、E_B、E_C1、E_C2、E_D1和E_D2，对应功能循环的连续阶段：初始泛素识别、AAA-ATP酶内底物插入、底物转运启动及底物降解。值得注意的是，RPN11作为AAA-ATP酶环中心通道入口的守门者，协调底物去泛素化与转运。在E_B状态，RPN11的Insert-1环形成β发夹结构，结合泛素的C端链，同时与RPT5的N环(残基99-119)相互作用。这种构型与RPN11和AAA-ATP酶马达的协同作用共同标志着底物转运和RPN11催化的去泛素化的启动。E_A、E_B和E_C状态下CP门控保持关闭，而在E_D状态下开放，允许底物进入CP内腔，整个功能循环中ATP水解沿AAA-ATP酶环顺序发生。

后续针对不同调控条件下蛋白酶体的冷冻电镜研究解析了大量底物结合蛋白酶体的中间构象状态，表明在盖亚基与泛素受体、AAA-ATP酶马达和CP门控层面存在层级调控。少数研究中，底物结合、CP门控开放且与E_D兼容的蛋白酶体状态也被称为加工态。这些研究共同构建了不对称、手递手的底物转运机制模型，由六个ATP酶亚基的孔环以高度灵活、动态的螺旋楼梯结构驱动。

USP14是蛋白酶体相关的三种DUB之一，与作为蛋白酶体固有DUB亚基的RPN11不同，USP14可逆地招募至蛋白酶体，通过提前移除底物上的泛素链抑制蛋白酶体活性。矛盾的是，USP14单独作用也可刺激蛋白酶体AAA-ATP酶活性。最终效应取决于时间顺序：若底物结合先于USP14激活，增强的ATP酶活性促进降解；若USP14激活先于底物结合，则抑制蛋白酶体降解。为阐明USP14这些不同且矛盾的效应如何在蛋白酶体上整合，研究人员采用时间分辨冷冻电镜可视化USP14结合的蛋白酶体降解多聚泛素化底物的过程，结合深度学习神经网络三维分类解析了13种USP14结合蛋白酶体的不同构象状态，在时空框架下为USP14介导的底物加工调控提供了机制见解。USP14的N端UBL结构域结合RPN1的T2位点，其催化USP结构域则与OB环和AAA-ATP酶环相互作用，靠近RPN11。USP14与ATP酶的动态相互作用解偶联ATP酶活性与RPN11催化的去泛素化，并在泛素识别、底物转运启动和泛素链循环三个阶段对蛋白酶体施加动力学检查点。

近期时间分辨冷冻电镜进一步用于可视化UBE3C相关蛋白酶体在降解超稳定折叠底物(此类底物即使经泛素化也难以被蛋白酶体降解)过程中的功能动力学。值得注意的是，UBE3C的N端片段在蛋白酶体外呈无序状态，以钥匙-锁方式插入盖亚基中央螺旋束附近的口袋。捕获到同时结合UBE3C和USP14的底物结合蛋白酶体的多个冷冻电镜重构结构，揭示了UBE3C对USP14的复杂拮抗作用。有趣的是，虽然USP14与蛋白酶体的结合促进UBE3C招募至蛋白酶体，但UBE3C剥夺了USP14的泛素结合优先权，通过创建从UBE3C到泛素受体和RPN11的极端捷径，完全绕过USP14并促进USP14从蛋白酶体循环。此外，UBE3C似乎独立于其连接酶活性促进AAA-ATP酶活性。这些协同作用逆转了USP14介导的蛋白酶体活性抑制，增强了降解持续性，这是强力降解超稳定底物所必需的。综上，这些扩展的冷冻电镜研究(尤其是时间分辨方法)定义了更接近生理状态下蛋白酶体复杂功能的原子水平功能图谱。

Inhibitors targeting the RP

如前所述，CP抑制剂已开发用于癌症治疗，但受限于剂量依赖性毒性、脱靶效应和获得性耐药。RP是抑制癌细胞蛋白酶体活性的替代治疗靶点。真核细胞中，RP通过其不同亚基识别并处理泛素化底物，因此提供了多个潜在药物靶点，可通过补充或替代CP靶向策略减少脱靶毒性和耐药性。原则上，抑制RP与抑制CP类似，均可抑制癌细胞蛋白酶体活性，导致底物蛋白积累并触发自噬性细胞死亡。小分子可通过破坏泛素识别、泛素链移除和ATP水解抑制蛋白酶体功能。

RPN10和RPN13是位于RP顶端的泛素受体，识别特定多聚泛素链。人RPN10包含两个泛素相互作用基序(UIMs)，RPN13含有一个可结合泛素链的UIM。小鼠RPN10 UIM结构域突变致死，而靶向RPN13可诱导多发性骨髓瘤(MM)细胞死亡并克服蛋白酶体抑制剂耐药，表明RPN13是极具潜力的治疗靶点。RP结构分析显示，RPN13的N端pleckstrin样泛素受体(Pru)结构域与RPN2和泛素化底物相互作用。RA375、RA190和RA183共价结合RPN13的Cys88，从而抑制26S蛋白酶体活性。核磁共振研究表明RA190结合RPN13的Cys88，位于RPN13-RPN2界面附近，破坏RPN13在蛋白酶体上的锚定。RA183是RA190的衍生物，其双苄叉哌啶酮的间/对氯基团被对硝基取代，在高分级卵巢癌、三阴性乳腺癌和多发性骨髓瘤细胞中显示出活性。基于RA190开发的RA375引入硝基环取代基和氯乙酰胺弹头作为共价结合靶蛋白的反应性化学基团，对癌细胞系的活性比RA190高约10倍。KDT-11是一种拟肽类合成分子，以非共价方式结合RPN13而不破坏已知的蛋白-蛋白相互作用，与RPN13 Pru结构域的β6/β7/β8链和α螺旋相互作用。TCL-1是另一种非共价结合剂，与Pru结构域相互作用并破坏RPN2-RPN13界面。

多聚泛素链招募后，RP利用DUB移除底物上的泛素链。RPN11属于JAMM/MPN金属蛋白酶家族，切割泛素-底物偶联物中的异肽键。在26S蛋白酶体内，RPN11活性与底物转运和降解以ATP依赖的方式偶联。Capzimin是一种有效的RPN11抑制剂，紧密结合酶的活性位点，通过非竞争性机制抑制其活性。8TQ是一种配位复合物，设计为结合RPN11催化位点的锌离子从而抑制其活性。硫柳汞是一种锌螯合剂，可抑制RPN11及其他JAMM金属蛋白酶，包括Csn5、AMSH和BRCC36。SOP6和SOP11属于表二硫代二酮哌嗪(ETP)类，可抑制RPN11活性，但其作用机制尚不清楚。

近期发现的雷帕霉素类似大环化合物rapaprotin是一种26S蛋白酶体组装抑制剂。Rapaprotin是雷帕霉素类似物库中的大环前药，其无活性前体可在细胞内转化为活性线性形式rapaprotin-L，选择性诱导多发性骨髓瘤和其他血液系统癌细胞凋亡，同时不影响非恶性细胞。全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定出脯氨酰内肽酶(PREP)是rapaprotin发挥活性所必需的，PREP将无活性的环状化合物转化为线性代谢物rapaprotin-L。Rapaprotin-L在细胞内蓄积，直接抑制CP的所有三个催化β亚基，阻断泛素-蛋白酶体功能，触发K48连接的多聚泛素化蛋白积累和内质网未折叠蛋白反应信号。时间分辨冷冻电镜显示，经rapaprotin-L处理的人26S蛋白酶体形成稳定的缺失盖亚基的中间体，最终导致RP解离，确立了基于解组装的抑制机制。Rapaprotin与硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米具有强协同作用，并可重新增敏患者来源的硼替佐米耐药多发性骨髓瘤细胞，凸显其作为首类蛋白酶体组装抑制剂的潜力。

Therapeutic targeting of the CP

癌细胞依赖升高的蛋白酶体活性维持蛋白质稳态并支持增殖。蛋白酶体抑制导致错误折叠蛋白积累并诱导凋亡。此外，抑制蛋白酶体降解阻止IκB周转，抑制NF-κB依赖的转录，促进肿瘤细胞死亡。恶性细胞中的蛋白酶体通常比正常组织中的对抑制更敏感。

尽管20S蛋白酶体的催化亚基β1、β2和β5共享保守的N端苏氨酸依赖的水解机制，但其底物特异性由不同的活性位点结构决定。S1特异性口袋(容纳底物的P1侧链)内的结构和物理化学差异产生了亚基特异性的微环境，调控肽段识别和催化效率。Thr1位于催化中心，邻近S1空腔，而残基45与其他口袋衬垫残基共同决定结合位点的尺寸、深度和静电特性。人CP的高分辨率结构分析进一步展示了小分子如何利用这些亚基特异性特征实现对单个催化中心的选择性结合。结构分析显示，β1的S1特异性口袋含碱性残基，偏好酸性底物；β2口袋富含酸性残基，容纳碱性侧链；β5口袋形成疏水空腔，容纳典型高亲和力抑制剂的大体积芳香族残基。因此，亚基选择性抑制可由保守N端苏氨酸催化机制内的局部活性位点环境差异解释。

MG132是一种肽醛，优先抑制β5的糜蛋白酶样活性，在低纳摩尔浓度下为可逆抑制剂，对β1和β2的抑制需更高浓度，同时还可抑制钙蛋白酶和组织蛋白酶，导致脱靶效应。硼替佐米于2003年获批用于治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤，可逆靶向β5的N端苏氨酸，抑制CP催化活性，对β1和β2活性较弱。硼替佐米通过促进IκB积累、抑制NF-κB信号传导并诱导蛋白毒性应激，导致内质网应激和caspase依赖的凋亡。临床应用受限于耐药性和剂量依赖性毒性。卡非佐米是第二代抑制剂，含环氧酮药效团，通过共价键不可逆修饰活性位点苏氨酸，与硼替佐米相比对β5具有更高的选择性和结合亲和力。伊沙佐米是一种口服生物可利用的可逆抑制剂，主要靶向β5，通过蛋白毒性应激诱导凋亡。

这些抑制剂优先靶向β5的糜蛋白酶样活性，这与β5对整体蛋白水解的主要贡献及其活性位点口袋的结构特征一致。蛋白酶体抑制剂同时抑制泛素依赖和非依赖的降解途径，临床应用伴随血液毒性和周围神经病变，且在大多数实体瘤中疗效有限。Marizomib不可逆抑制β1(IC₅₀430 nM)、β2(IC₅₀28 nM)和β5(IC₅₀3.5 nM)，在多发性骨髓瘤临床研究中显示出活性。综上，结构与药理学研究证实β亚基活性位点的差异结构为亚基选择性抑制提供了机制基础。尽管β5靶向抑制剂已取得显著临床成功，但更广泛靶向多个催化位点可能提供更互补的治疗潜力，但代价是毒性增加。因此，基于详细结构理解的理性设计对推进蛋白酶体靶向治疗至关重要。

内在无序蛋白(IDPs)在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病中异常积累，破坏蛋白质稳态。近期研究表明，工程化高活性20S蛋白酶体(α3ΔN)可有效清除IDPs和错误折叠蛋白，减少氧化损伤，改善秀丽隐杆线虫的蛋白质稳态，提示其在神经退行性疾病中的潜在治疗价值。

基于CP的结构分析，研究人员提出了两种20S激活剂的设计策略：一是靶向β亚基提高催化活性，二是靶向α亚基调控门控开放。与小分子直接增强β1、β2和β5催化活性相比，调控CP门控开放是更常用的策略。某些小分子通过结合α环促进门控开放增强CP肽酶活性，但具体机制尚不清楚。RP和其他调控复合物利用HbYX基序通过结合α口袋激活CP，诱导α环构象变化从而打开门控。这一发现提示基于HbYX基序的肽可能具有治疗潜力。名为ZYA的化合物是一种HbYX基序肽模拟物，据报道可激活哺乳动物蛋白酶体。分子对接研究表明，它可靶向人20S蛋白酶体α5和α6之间的α口袋，类似于HbYX基序的作用。此外，嗜酸热原体20S蛋白酶体与ZYA结合的冷冻电镜结构显示，ZYA结合20S亚基间α口袋，触发参与蛋白酶体门控开放的Lys66和口袋背环的重排。

Proteolysis-targeting strategies

靶向蛋白降解(TPD)是一种旨在选择性清除疾病相关蛋白的治疗策略。与传统抑制剂不同，TPD通过催化、亚化学计量机制发挥作用，单个降解剂分子可诱导多个目标蛋白降解，无需持续占据靶点即可产生药理效应，有助于攻克传统上“不可成药”的靶点。该方法主要依赖小分子降解剂，诱导目标蛋白与E3泛素连接酶接近，导致底物多聚泛素化并随后被蛋白酶体降解。这些降解剂大致分为蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)和分子胶降解剂(MGDs)。PROTACs是双功能分子，由两个配体通过连接子连接：一个结合目标蛋白，另一个结合E3连接酶，从而将底物招募至连接酶表面，促进其泛素化与降解。分子胶通常是单价小分子，诱导或稳定E3连接酶与新底物之间的新型蛋白-蛋白相互作用界面，通过不同但概念相关的机制促进选择性降解。

值得注意的是，某些E3连接酶包括UBE3C、E6AP和Parkin已被报道与RP相关联。因此，招募此类蛋白酶体相关E3连接酶的PROTACs或MGDs可实现泛素化底物向26S蛋白酶体的高效直接递送，从而提高降解特异性和效率。尽管传统PROTACs和MGDs不直接调控蛋白酶体催化活性，但近期针对UBE3C改造蛋白酶体的结构研究提示，靶向UBE3C的PROTAC或MGD可能更有效地将新底物递送至蛋白酶体以实现增强降解，这也为基于蛋白酶体的药物发现提供了替代范式。

除经典的E3连接酶介导的泛素化外，某些穿梭因子可直接将底物递送至26S蛋白酶体。基于此概念，研究人员开发了直接招募蛋白酶体的降解剂，将目标蛋白拴系至蛋白酶体亚基，从而绕过对特定E3连接酶的依赖。例如，一种新型双功能小分子可同时结合RPN1和BRD4，通过直接招募蛋白酶体实现底物降解。结构导向策略可利用结合蛋白酶体受体(如RPN1或RPN13)或蛋白酶体相关穿梭因子的配体，促进底物招募并进入降解通路。这种方法有望克服因特定E3连接酶突变产生的耐药性，并显著扩大可降解蛋白的范围。

Outlook

高分辨率冷冻电镜分析解析了多种条件下26S蛋白酶体的底物加工状态。这些进展不仅揭示了协调泛素识别、去泛素化、解折叠和CP门控开放的ATP酶驱动构象转变，也阐明了蛋白酶体如何受DUBs、E3连接酶及其他细胞辅助因子调控。尽管蛋白酶体的结构“宇宙”不断扩展，现有冷冻电镜重构仅代表冰山一角，很可能仅反映了最易观察到的构象体。细胞内的蛋白酶体是否以及如何与其他众多辅助因子或复杂机器相互作用，从而在从蛋白质质量控制到蛋白质周转精准调控的基本功能中发挥作用，仍有待探索。

关于26S蛋白酶体在不同功能状态下的结构图谱知识不断扩展，也使研究人员能够结构导向和计算辅助地调控催化与调控组分。靶向蛋白降解技术进一步利用了泛素-蛋白酶体系统。降解剂诱导的周转效率不仅取决于三元复合物形成和泛素链拓扑结构，还取决于蛋白酶体招募和底物加工动力学。E3连接酶与蛋白酶体亚基的相互作用以及蛋白酶体相关穿梭因子，提示了泛素化与降解之间更直接偶联的潜在机制。未来的结构研究将有助于将研究人员对E3-蛋白酶体相互作用的理解扩展到UBE3C/Hul5之外。是否存在更通用的机制允许更多E3连接酶直接与蛋白酶体相互作用，仍有待明确。

蛋白酶体介导的蛋白水解由CP与RP之间的协调催化活性和动态通讯调控。癌细胞中升高的蛋白毒性负荷使其对蛋白酶体降解具有更高的依赖性，使该系统成为生化脆弱点。抑制蛋白酶体破坏受调控的蛋白水解流，诱导蛋白毒性应激，优先损害恶性细胞存活。临床批准的CP抑制剂优先靶向β5催化亚基，与N端Thr1形成共价加合物，从而阻塞催化腔内的底物结合位点。结构和酶学研究已阐明抑制剂的结合模式。然而，亚基选择性抑制对26S蛋白酶体不同功能状态的构象后果仍不完全清楚。另一方面，合成蛋白酶体激活剂是增强治疗靶点降解的可行策略，可与PROTACs或MGDs联合用于传统不可成药蛋白。通过解码UPS的精确调控机制，更多蛋白互作辅助因子可被开发为潜在治疗靶点，通过理性从头设计干预分子，为超越PROTAC或MGDs解决未满足的医疗需求开辟新机遇。