鼻内氟化纳米佐剂可调控CCL2介导的预树突状细胞募集及经黏膜抗原递送，从而激发针对流感的长期免疫力

《Journal of Controlled Release》：Intranasal fluorinated nano-adjuvant orchestrates CCL2-driven pre-DC recruitment and transmucosal antigen delivery to elicit long-term immunity against influenza

　　

沈玲丽|杨浩祥|周恒奇|刘子阳|段来通|王书琪|牛群|吴亚楠|张改平|何华

中国河南省郑州市河南农业大学国家动物免疫学国际联合研究中心兽医学院，邮编450046

摘要

鼻喷疫苗具有在病毒入侵门户处引发黏膜免疫、预防流感感染的独特优势。然而，其效果受到两大障碍的制约：用于抗原呈递的常驻常规树突状细胞数量有限，以及抗原难以穿透黏膜传递。为此，我们设计了一种多功能鼻喷疫苗纳米佐剂——甘露糖修饰的氟化PEI（MFPEI），以协同克服这些难题。MFPEI结合了氟烷介导的黏液渗透作用、甘露糖辅助的树突状细胞靶向功能以及TLR4/NF-κB信号通路的激活作用。氟化结构使MFPEI/HA具备疏水性和避脂性，从而减少黏蛋白对疫苗的包裹，显著提升抗原在黏膜层的渗透能力。同时，MFPEI能激活树突状细胞中的TLR4/NF-κB信号通路，促进CCL2的分泌，进而通过CCR2-CCL2信号通路吸引前体树突状细胞，补充鼻腔内的树突状细胞网络。这一双重策略最大限度地提升了抗原的摄取与呈递能力，从而产生强大且持久的黏膜免疫和系统免疫，为抵御流感感染提供全面保护。我们的研究表明，MFPEI有望成为下一代针对流感及其他呼吸道病原体的鼻喷疫苗的理想纳米佐剂平台。

引言

尽管已广泛开展疫苗接种工作，流感依然是一个严重的全球健康威胁，每年都会造成大量人群患病、死亡，并带来巨大的经济损失[1]、[2]、[3]、[4]。与传统注射式流感疫苗相比，鼻喷流感疫苗有望激发强大的黏膜免疫，而黏膜免疫是抵御呼吸道病原体的第一道防线，对于防止病毒在呼吸道表面进入并传播至关重要[5]、[6]、[7]、[8]。值得注意的是，常规树突状细胞能够在鼻黏膜表面形成半连续的网络，作为免疫哨兵，负责检测、捕获抗原，随后迁移到引流淋巴结，启动针对病毒感染的先天性和适应性免疫反应[9]。这些树突状细胞可进一步分为cDC1和cDC2两类[10]、[11]。cDC1能够通过MHC-I将抗原呈递给CD8 T细胞，从而引发Th1免疫反应；而cDC2则主要通过MHC-II将抗原呈递给CD4 T细胞，进而激活Th2和Th17免疫反应[12]、[13]。然而，一个关键的局限性在于，抗原被捕获并迁移到淋巴结后，有限的常驻树突状细胞数量可能不足以实现最大程度的抗原捕获，这可能会影响免疫反应的强度和持续时间[14]、[15]。

树突状细胞源自从骨髓中释放出来的前体树突状细胞，它们进入血液后可被招募到黏膜部位[16]、[17]、[18]。研究表明，当鼻黏膜受到病原体或疫苗刺激时，当地的免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞和上皮细胞）会在Toll样受体4被激活后释放CCL2。这种CCL2趋化因子会吸引表达CCR2受体的前体树突状细胞聚集到感染或炎症部位[14]、[19]、[20]。重要的是，CCR2-CCL2信号通路不仅有助于快速动员前体树突状细胞，还能促进其在鼻黏膜内的分化与成熟，进而提升其抗原呈递能力。此外，TLR4信号通路的激活不仅能诱导CCL2的表达，还会刺激其他趋化因子的分泌，如CCL20和CXCL8，从而形成有利于前体树突状细胞聚集的趋化梯度[21]、[22]。因此，结合TLR4激活佐剂的鼻喷流感疫苗，有望通过有效招募前体树突状细胞来增强免疫反应。

覆盖鼻上皮的黏膜层是对有效抗原递送的巨大障碍[23]、[24]。虽然亚单位疫苗通常被认为是安全的，但鼻喷给药往往无法引发强烈的免疫反应，主要原因在于黏膜清除机制以及抗原渗透能力有限[25]。为了解决这些问题，人们开发了基于聚合物的黏膜纳米佐剂，如壳聚糖和聚乙烯亚胺，这类佐剂能够提高抗原的稳定性，延长其在鼻腔内的停留时间，从而促进抗原向抗原呈递细胞的递送[26]、[27]、[28]。然而，这类阳离子纳米佐剂容易吸附带负电的黏蛋白糖蛋白，导致纳米疫苗被包裹在黏液层中，进而加速黏液纤毛的清除过程[29]、[30]、[31]。近年来，氟化聚合物，如氟化聚乙烯亚胺，被视为实现蛋白质跨黏膜递送的优质候选材料[32]、[33]、[34]。氟碳材料的独特疏水性和避脂性使得FPEI能够抵抗黏蛋白糖蛋白的吸附，从而提升其在黏膜层的渗透能力[35]、[36]。值得注意的是，已有研究证明FPEI可通过激活TLR4/NF-κB信号通路发挥纳米佐剂的作用[37]、[38]。因此，我们推测FPEI可以作为一种双功能黏膜纳米佐剂，既能招募前体树突状细胞，又能帮助抗原穿透黏膜，从而最大化树突状细胞对抗原的摄取量，进而增强免疫反应。

在本研究中，我们设计了一种基于氟聚合物的鼻喷疫苗纳米佐剂，该佐剂可通过协同作用提升前体树突状细胞的招募效率以及抗原的跨黏膜递送能力，从而增强机体对流感感染的长期免疫防御能力（见图1）。我们首先合成了两种氟烷接枝的甘露糖修饰聚乙烯亚胺，随后将其与流感血凝素抗原混合，制成了鼻喷纳米疫苗MFPEI/HA。与传统阳离子佐剂不同，MFPEI结合了氟烷介导的黏膜渗透作用、甘露糖辅助的树突状细胞靶向功能以及TLR4/NF-κB信号通路的激活作用，有效突破了鼻喷疫苗应用中的关键障碍。尤为重要的是，MFPEI能够有效避免被黏蛋白包裹，从而确保流感血凝素抗原能够高效地穿透黏膜递送。此外，它还作为一种TLR4激活佐剂，能够刺激树突状细胞分泌CCL2，进而通过CCR2-CCL2信号通路吸引前体树突状细胞。这种双重功能有效地补充了不断减少的树突状细胞网络，进而最大化抗原的摄取量，促进树突状细胞的成熟，最终引发T细胞和B细胞的活化，增加IgA和IgG的抗体的生成。最终，无论是黏膜免疫还是系统免疫都得到了增强，为机体提供了长期抵御流感侵袭的保护。我们的研究结果表明，MFPEI是一种极具应用价值的平台，可用于增强强大的黏膜免疫和系统免疫，展现出其作为流感及其他呼吸道传染病鼻喷疫苗佐剂的巨大潜力。

章节节选

MFPEI/HA的合成与表征

按照先前报道的方法[38]，PEI与3-(全氟己-1-基)-1,2-丙烯氧化物以不同的投料比例（25:1、50:1）进行结合，从而得到了氟化聚乙烯亚胺，分别命名为F₂₅PEI和F₅₀PEI。随后，F₂₅PEI和F₅₀PEI分别与甘露糖-PEG-COOH发生反应，进而得到MF₂₅PEI和MF₅₀PEI。¹H NMR谱图显示PEI已经成功实现了氟化处理，这一点可从3.1–3.5?ppm处的峰形变化中得到证实（见图S1）。傅里叶变换红外光谱也

结论

总之，我们开发出一种甘露糖修饰的氟化聚乙烯亚胺（MF₂₅PEI），作为一种鼻喷纳米佐剂，它能够有效协调前体树突状细胞的招募以及抗原的跨黏膜递送，从而引发强烈且持久的免疫反应，帮助机体抵抗流感感染。MF₂₅PEI/HA鼻喷疫苗的制备非常简单，只需将流感血凝素抗原与MF₂₅PEI混合即可，由此得到的制剂具有诸多优异特性，包括流感血凝素抗原稳定性更高、抗原能够定向递送到树突状细胞中，以及

流感血凝素的表达与纯化

流感血凝素的表达与纯化是按照先前报道的方法[50]进行的。简而言之，首先按照制造商的说明，使用PEI_40k将流感血凝素基因载体转染到HEK293F细胞中，转染72小时后，通过离心（1500?rpm，4?°C，5?分钟）收集上清液，随后再利用Ni-NTA亲和柱对上清液中的目标蛋白进行纯化。纯化后的流感血凝素蛋白通过SDS-PAGE和Western blot技术进行了分析。

MFPEI的合成

MFPEI的合成也是依据先前报道的方法[38]进行的。简述如下：

作者贡献说明

沈玲丽：负责文章的初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建等工作。杨浩祥：参与方法学设计、数据分析及数据整理工作。周恒奇：参与方法学设计、数据分析及数据整理工作。刘子阳：负责实验研究及数据整理工作。段来通：负责实验研究及数据整理工作。王书琪：参与方法学设计及数据分析工作。牛群：参与方法学设计及数据分析工作。吴亚楠：负责课题的总体监督工作。张改平：负责课题的监督工作以及相关资源的协调工作。何华：负责文章的审稿与修改工作。

利益冲突声明

所有作者均声明不存在任何利益冲突。

致谢

本项研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：32473118）、中原科技创新领军人才计划（项目编号：30603404）以及河南省高校科技创新人才计划（项目编号：26HASTIT023）的支持。