多组学研究揭示了新雪颗粒剂通过激活cAMP/EPAC/CREB轴对抗特发性肺纤维化的作用机制

《Journal of Ethnopharmacology》：Multi-omics reveals the effects and mechanisms of Xinxue Granules against idiopathic pulmonary fibrosis through activating the cAMP/EPAC/CREB axis

　　夏章|环丽|张凯轩|史亚军|黄倩倩|郭东燕|张晓飞|翟炳涛|杨学琴|栾飞|邹俊波

中国陕西省咸阳市712046，陕西中医药大学药学院中药新药与基础研究陕西省重点实验室

摘要：民族药理学意义
辛雪颗粒是一种传统中药方剂，源自中医经典方剂“紫雪散”，后者属于中医三大珍方之一。该方基于清热解毒的原则，长期用于治疗热毒积聚引起的呼吸系统疾病。由于其多成分结构，已有研究表明辛雪颗粒可调节炎症反应并减轻肺损伤。然而，其在肺纤维化样损伤中的保护作用及作用机制尚不清楚。

研究目的
探讨辛雪颗粒在肺纤维化中的保护作用及其机制。通过随机分组建立博来霉素诱导的肺纤维化样损伤小鼠模型，通过组织病理学和生化分析评估其治疗效果。结合网络药理学、代谢组学和转录组学分析，识别潜在作用通路。此外，还利用TGF-β1诱导的MLE-12细胞进行体外实验，通过ESI-09抑制EPAC，进一步探究其作用机制。

材料与方法
为评估辛雪颗粒的抗纤维化作用，建立了博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型。采用超高效液相色谱联用四极杆飞行时间质谱技术分析辛雪颗粒的化学成分及血清吸附成分。通过网络药理学、转录组学和非靶向代谢组学分析，确定潜在靶点和作用通路。通过组织病理学、生化检测、定量实时PCR和Western blot等体内实验，验证关键分子机制。同时利用TGF-β1刺激的MLE-12细胞并结合ESI-09抑制EPAC进行体外实验以探索机制。通过分子对接技术评估化合物与靶点的相互作用。所有植物名称均依据世界植物在线数据库核实。

结果
UPLC-Q-TOF/MS分析发现辛雪颗粒有20种血清吸附成分，网络药理学分析得出222个潜在靶点，其中环腺苷酸信号通路尤为突出。辛雪颗粒可减轻博来霉素诱导小鼠的肺损伤、炎症细胞因子水平、成纤维细胞活化及细胞外基质沉积。从机制上看，辛雪颗粒在体内和体外均能增加EPAC表达和CREB磷酸化，同时降低GLI3表达，这与cAMP信号通路的激活一致。使用ESI-09抑制EPAC可部分逆转辛雪颗粒对纤维化及相关标志物的影响。

结论
辛雪颗粒通过抑制炎症和成纤维细胞活化，减轻博来霉素诱导的肺纤维化样损伤。其保护作用可能部分通过cAMP/EPAC/CREB信号通路实现。这些结果表明，辛雪颗粒有望成为治疗肺纤维化的多靶点候选药物。

引言
特发性肺纤维化是一种慢性且致命的间质性肺病，其特征是成纤维细胞异常增殖以及肺实质内过度沉积细胞外基质，从而导致肺功能不可逆丧失（Ouji-Sageshima等人，2024；Rajesh等人，2023）。临床上，IPF患者通常表现为进行性呼吸困难及低氧血症，中位生存期约为3-5年（Ma等人，2024）。目前，尼达尼布和吡非尼酮是唯一获批用于治疗IPF的抗纤维化药物（Maher，2024）。但这些药物仅能延缓疾病进展，无法逆转已形成的纤维化，且常伴有不良反应。因此，阐明IPF发病的分子机制并寻找新的治疗靶点仍是亟需解决的临床问题（Confalonieri等人，2022；Lu等人，2022）。从病理学角度看，IPF是由反复的肺泡上皮损伤、异常的修复反应以及成纤维细胞持续活化所驱动，进而导致细胞外基质过度积累和肺结构进行性重塑（Nakamura和Shimizu，2023；Sul等人，2022）。成纤维细胞向肌成纤维细胞分化、上皮-间质转化以及胶原沉积等过程被认为是纤维化进展中的关键环节（Bhatt等人，2025）。重要的是，这些过程并非孤立发生，而是由高度相互关联的信号网络共同调控，从而控制成纤维细胞活化、炎症反应及基质稳态（Fang等人，2026；Nie等人，2023）。这种复杂性表明，有效的治疗策略可能需要针对协调多种纤维化途径的关键调控节点，而非仅聚焦于单一下游效应分子（Ghanem等人，2024）。

环腺苷酸是一种经典的细胞内第二信使，在调节细胞增殖、炎症信号传导及细胞外基质稳态方面起着关键作用，因此被视为重要的整合信号分子（Insel等人，2012；Jankowski等人，2025b；Wang等人，2025）。越来越多的证据表明，cAMP信号通路在IPF的发病过程中起着重要作用（Roberts等人，2018）。cAMP通路的激活可抑制转化生长因子-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，同时降低α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原等促纤维化标志物的表达（Guan等人，2020；Harding-Fox和Cellek，2025）。这种抗纤维化作用主要通过cAMP依赖性的蛋白激酶A激活实现，后者可抑制肺成纤维细胞增殖并调控细胞外基质的生成（Huang, M.等人，2025；Jankowski等人，2025a）。相反，cAMP信号传导受损或失调则与肺纤维化进展过程中的成纤维细胞持续活化及过度细胞外基质沉积有关。除经典的PKA通路外，cAMP还可通过直接由cAMP 1激活的交换蛋白发挥信号作用，从而调节免疫细胞、成纤维细胞及上皮细胞的表型（Peters-Golden和Fortier，2026）。值得注意的是，cAMP/EPAC/CREB信号通路的激活可抑制促炎细胞因子的产生，减轻成纤维细胞活化，并在病理状态下维持组织稳态。而cAMP信号传导障碍则会加剧炎症和成纤维细胞活化，促进细胞外基质过度积累（Huang, M.等人，2025；Wu等人，2021）。此外，提高细胞内cAMP水平可通过抑制成纤维细胞增殖、减少肌成纤维细胞分化及降低胶原沉积，缓解实验性肺纤维化模型中的纤维化表现（Farh等人，2025）。综上所述，这些研究结果强调了cAMP信号通路在肺纤维化中的核心调控作用，为其作为抗纤维化治疗靶点提供了依据。考虑到IPF的复杂性，同时调节多种信号通路的干预措施可能具有更好的治疗效果（Zheng等人，2024）。传统中药以其多成分、多靶点协同作用的特点，长期以来被用于治疗涉及全身功能紊乱的复杂疾病（Huang, B.等人，2025；Yao等人，2026；Zeng等人，2024）。

辛雪颗粒是一种由矿物、植物和动物源药材制成的传统中药方剂，广泛用于临床和民间医学，用于治疗发热性疾病及呼吸系统炎症疾病，如上呼吸道感染和支气管炎（Yu Shanqiang，2006）。该方剂源自中医经典方剂“紫雪散”，这一方剂在中医史上一直用于治疗严重发热病症，辛雪颗粒在保留“清热解毒”治疗原则的同时，也经过调整以适应现代临床需求（Zhang等人，2023）。根据中医理论，肺纤维化可视为“本虚标实”的病症，表现为内热积聚、血瘀及肺络阻塞（Ma等人，2026）。尽管这些概念与现代生物医学术语有所不同，但大体上反映了肺纤维化的若干病理特征，如持续性炎症、组织损伤及纤维化重塑（Zhang等人，2018；Zhang, Z.等人，2026）。先前的研究表明，辛雪颗粒具有抗炎和抗病毒活性，但其在肺纤维化中的作用机制仍不明确。从药理学角度来看，辛雪颗粒中的多种成分具有与纤维化形成及组织重塑调节密切相关的生物活性。冰片可通过抑制NADPH氧化酶或蛋白激酶C信号传导，减少活性氧的产生，从而抑制中性粒细胞外陷阱的形成（Chen等人，2022）。穿心莲及其主要活性成分穿心莲内酯在多种实验性疾病模型中表现出显著的抗炎、抗氧化及抗上皮-间质转化作用（Li等人，2020；Liu等人，2021）。此外，栀子及其生物活性成分如栀子苷可通过激活SIRT1/FXR通路并抑制NLRP3炎性小体激活，减轻纤维化进展（Qin, T.等人，2023）。我们之前的研究显示，辛雪颗粒可显著减轻大鼠脂多糖诱导的发热和全身炎症反应，这一效应与VEGF相关信号通路的激活及血管结构的保持有关（Zhang, K.等人，2026）。总体而言，这些研究结果表明，辛雪颗粒具有多种与纤维化发病相关的药理特性，可能通过协调调节多种信号通路而非单一分子靶点来发挥抗纤维化作用。辛雪颗粒的详细成分见补充表S1，所有植物名称均通过世界植物在线数据库核实（访问日期：2025-07-02，http://www.worldfloraonline.org）。

尽管已有大量证据支持辛雪颗粒的抗炎和退热作用，但其在肺纤维化中的治疗潜力及作用机制尚未得到系统研究。因此，本研究旨在评估辛雪颗粒对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化样损伤的保护作用。首先采用超高效液相色谱联用四极杆飞行时间质谱技术分析辛雪颗粒的化学成分及血清吸附成分。随后通过网络药理学分析，预测与辛雪颗粒抗纤维化作用相关的潜在治疗靶点及信号通路。接着通过转录组学和代谢组学整合分析，进一步阐明辛雪颗粒可能调控的分子机制和信号网络。鉴于多组学分析的探索性质，关键发现还通过定量实时PCR和Western blot分析进行了进一步验证。此外，还建立了TGF-β1诱导的MLE-12细胞模型，并结合ESI-09药物抑制，进一步探讨cAMP/EPAC/CREB信号通路在辛雪颗粒保护作用中的作用。

试剂与化学品
辛雪颗粒（批号240302）购自陕西康纳多药业有限公司（中国咸阳）。吡非尼酮（批号J23IS218234）购自江苏酶免疫测定业有限公司（中国江苏）。用于检测小鼠白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、羟脯氨酸、I型胶原、纤连蛋白、结缔组织生长因子及总胶原的酶联免疫吸附试验试剂盒（均为批号20250506），亦购自该公司。

通过UPLC-Q-TOF/MS分析辛雪颗粒的化学成分及血清吸附成分
采用正负离子模式，通过UPLC-Q-TOF/MS分析辛雪颗粒、含药物的血清以及空白血清的化学成分。生成了总离子色谱图（图2A-F）。在正离子模式下，可检测到[M+H]+和[M+Na]+离子对应的峰；而在负离子模式下，则可观察到[M-H]?、[M+FA-H]?和[M-H+HAc]?对应的峰。鉴定后，通过Q-TOF MS确定各化合物的m/z值，再通过MS/MS进一步分析。

讨论
博来霉素诱导的肺纤维化模型被广泛用于模拟人类肺纤维化的关键病理特征，常用于评估潜在的抗纤维化药物。IPF是一种致命的间质性肺病，其特征是肺结构进行性重塑及细胞外基质过度沉积，最终导致肺结构不可逆破坏及呼吸衰竭（Clynick等人，2022；Li, R.M.等人，2025）。IPF的进展过程包括……

结论
总之，辛雪颗粒可减轻博来霉素诱导小鼠模型中的肺纤维化样损伤，同时降低炎症反应、细胞外基质沉积及成纤维细胞活化程度。这些作用可能部分与cAMP/EPAC/CREB信号通路的调节有关（图11）。总体而言，这些研究结果为进一步研究辛雪颗粒作为肺纤维化样损伤的多靶点候选药物提供了初步依据。

作者贡献声明
翟炳涛：正式分析。张晓飞：资金获取、正式分析。郭东燕：正式分析、数据整理。黄倩倩：软件应用、方法设计。栾飞：监督指导、资金获取、概念提出。邹俊波：论文撰写与编辑、监督指导、项目管理、资金获取、概念提出。杨学琴：数据整理。史亚军：验证工作、资源提供、方法设计。张凯轩：结果可视化、正式分析、数据整理。黄丽：未标注参考文献的文献包括黄等人，2025年；李等人，2025年；李等人，2025年；梅等人，2023年；秦等人，2023年；徐等人，2026年；余善强和赵某，2006年；张等人，2026年。数据获取方式：数据将应要求提供。利益冲突声明：作者声明不存在任何利益冲突。资金支持：本研究得到了陕西省教育厅重点科学研究项目计划（编号25JR059）、陕西中医药大学科技创新人才计划（编号2024-CXTD-03）、陕西省中医药管理局科技创新团队项目（编号2025-CXTD-02）以及陕西省中医药管理局科研创新团队项目（编号TZKN-CXTD-03）的财政支持。利益冲突声明：?作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。