从双峰骆驼胎盘中筛选抗皮肤衰老多肽：基于MMP-1抑制作用的多功能筛选、网络药理学分析及体外验证

《Journal of Ethnopharmacology》：Targeted Discovery of Anti-Skin Aging Peptides from Camelus bactrianus Placenta: Multi-activity Screening, Network Pharmacology, and In Vitro Validation Focusing on MMP-1 Inhibition

　　林坤坤|马青山|吴悦|王丹丹|王毅|徐海荣|张正东|林哲源|曹坤|苏华|赵琳|泰宗光|王方远|张巧燕|孙泽宇|秦璐萍|张全龙

中国浙江中医药大学药学科学学院，杭州311402

摘要：民族药理学意义
胎盘在传统医学中一直被用作治疗药物，尤其在中医中被称为“紫河车”。同样，双峰驼胎盘在蒙医中被称作“哈利亚苏”，传统上被用于改善健康、减少皱纹及缓解衰老迹象。然而，其抗皮肤衰老的功效及相关分子机制尚未得到科学验证，本研究旨在解决这一问题。

研究目的
本研究旨在评估双峰驼胎盘酶解产物抗皮肤衰老的潜力，识别其中的活性肽，并阐明相关的分子靶点机制。

材料与方法
共制备了11种双峰驼胎盘酶解产物，通过水解效率、抗氧化活性以及细胞外基质降解酶抑制作用对其进行筛选。在D-半乳糖诱导的人皮肤成纤维细胞衰老模型及衰老C57BL/6小鼠模型中验证了最合适的酶解产物。通过网络药理学分析、分子对接结合分子动力学模拟，确定了核心治疗靶点和活性肽，随后在人皮肤成纤维细胞中进一步验证了这些结果。

结果
CBPH-Flavourzyme具有强效的抗氧化活性，能有效清除ABTS+和DPPH自由基；可抑制胶原酶、弹性蛋白酶及基质金属蛋白酶-1等细胞外基质降解酶；通过显著降低衰老相关β-半乳糖苷酶、IL-6和IL-18的水平，同时增加I型胶原蛋白的合成，从而减轻人皮肤成纤维细胞的衰老程度。在D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型中，CBPH-Flavourzyme能显著提升超氧化物歧化酶和透明质酸水平，降低丙二醛含量，促进背部皮肤组织中I型胶原蛋白的生成，改善胶原纤维排列紊乱状况，并增加皮肤厚度，进而发挥抗皮肤衰老作用。网络药理学分析表明，CBPH-Flavourzyme能够调节胶原蛋白降解，抑制D-半乳糖诱导的衰老小鼠皮肤组织中参与胶原蛋白降解的关键酶的表达。体外酶抑制试验结合分子对接与分子动力学模拟，从CBPH-Flavourzyme中鉴定出7种肽段（FRCQ、AADW、PGSPP、PSSPF、PGFGAG、PAF和QGVGF）为强效的MMP-1抑制剂，其中FRCQ的抑制活性最强。后续细胞实验表明，FRCQ可显著降低SA-β-半乳糖苷酶活性并增加I型胶原蛋白含量，同时降低AP-1相关蛋白p-c-Fos和p-c-Jun的水平，这说明调节AP-1信号通路可能有助于发挥其抗衰老作用。

结论
这些研究结果表明，双峰驼胎盘衍生的肽段有望作为功能性食品、营养化妆品或药品开发的候选物质，不过还需进一步研究其在皮肤中的渗透性、安全性及配方稳定性。

引言
皮肤衰老是一个多因素参与的生物过程，受内在遗传因素与外在环境因素的共同影响（Chen等人，2026）。这一渐进性退化现象体现在宏观、功能及微观层面。宏观上，皮肤衰老表现为细纹出现、弹性下降、质地改变，常伴有干燥和粗糙现象（Wang, Z.等人，2025）。功能上，表皮免疫功能紊乱会增加皮肤敏感性，提高过敏反应和慢性炎症的风险，同时降低皮肤的再生能力（Salamito等人，2025）。微观上，皮肤衰老与表皮细胞有丝分裂速率下降有关，这会削弱细胞的支撑作用，加速组织层面的衰老进程（Wlaschek等人，2025）。皮肤衰老的潜在机制包括氧化应激和炎症，这些因素最终会导致细胞外基质蛋白，尤其是胶原蛋白的合成受阻且降解加速（Noroozi等人，2025）。在这一过程中，基质金属蛋白酶的过度表达是一个关键分子事件，这类酶负责分解皮肤基质中的重要成分，如胶原蛋白和弹性纤维（Tang等人，2025）。其中，MMP-1又称间质胶原酶，是启动I型和III型胶原蛋白分解的主要酶，而这两种胶原蛋白是真皮层中最重要的结构蛋白（Lai等人，2026）。由于MMP-1催化了胶原蛋白分解的初始且限速步骤，其过度表达会直接导致胶原蛋白耗竭及皮肤结构不稳定。因此，抑制MMP-1活性不仅是揭示皮肤衰老机制的重要策略，也为开发有效的抗衰老及皮肤修复产品提供了可能（Nagase等人，2006）。

世界各地的传统医学体系中，长期以来一直使用各种哺乳动物的胎盘，因其具有恢复活力、滋养身体及促进再生的功效（Mode等人，2019）。其中，猪、羊、马和鹿的胎盘提取物已被广泛研究并应用于化妆品和功能性食品中，其在缓解光老化及改善皮肤质地方面具有显著效果（He等人，2025；Nagae等人，2022；Nguyen等人，2025；Tansathien等人，2022）。骆驼是一种适应恶劣沙漠环境的典型家畜，其乳汁、初乳和胎盘等副产品在蒙古和中亚的民族医学中具有独特的营养和药用价值（Chen等人，2019；MoDe等人，2019；Si等人，2015）。双峰驼胎盘是胎儿发育期间重要的临时器官，由于双峰驼极强的环境适应能力，该胎盘具有极高的活力和生物活性。它是一种通过蒙古医学长期实践形成的动物源性药材，至今仍在使用。在蒙古传统医学中，双峰驼胎盘被干燥后磨成粉末，内服以增强整体健康并治疗代谢性疾病。尽管本研究采用了酶解法——一种不同于传统粉末制法的现代技术——但这种方法能够系统地筛选并识别出具有传统药用功效的特定生物活性肽，从而为这一传统用法提供科学依据（Chen, W.Y.等人，2025）。初步研究表明，双峰驼胎盘含有高水平的生物活性蛋白质、肽类和抗氧化剂，在体外具有自由基清除能力，在动物模型中也表现出抗衰老效果（Mo等人，2023）。最近的研究还发现，双峰驼胎盘的可溶性蛋白及酶解产物可通过增强抗氧化酶活性、降低脂质过氧化程度、改善皮肤弹性和减少皱纹，来缓解豚鼠因UVB照射引起的皮肤光老化（Tong，2019）。多种理论模型认为，这些提取物能够促进胶原蛋白合成、发挥抗氧化作用并推动细胞更新。尽管在民族医学中应用广泛，但导致这些抗衰老效果的具体生物活性成分，尤其是功能性肽类，目前仍不明确。因此，需要通过严格的实验验证来支持这些传统说法，并阐明其背后的分子机制。

酶解法利用蛋白酶的特异性切割机制实现可控的蛋白质降解。该方法在肽类生产方面具有明显优势，包括较高的反应选择性、良好的产率以及温和环保的加工条件（Gurumallesh等人，2019）。通过优化酶的选择及水解参数（如pH值、温度和底物浓度），再结合膜过滤和色谱等先进分离技术，可以显著提升所得肽类的营养价值和生理功能（Ekiz Terzio?lu等人，2026）。由于不同的蛋白酶能够识别特定的肽键，因此酶的选择直接影响酶解产物的氨基酸序列、分子量分布及最终生物活性（Zeng等人，2023）。在食品和生物加工行业中常用的商业蛋白酶包括胃肠道蛋白酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶）、植物来源的蛋白酶（木瓜蛋白酶），以及微生物蛋白酶，如碱性蛋白酶、Flavourzyme和中性蛋白酶（Barzkar，2020；Dyer和Weiss，2022）。例如，已有研究成功利用碱性蛋白酶和超滤技术从猪胎盘中分离出高度稳定的抗氧化肽段。虽然初步研究表明粗制双峰驼胎盘酶解产物也具有抗氧化及潜在的抗衰老作用，但其具体的生物活性肽序列尚未被明确鉴定（Chen, Q.等人，2024）。在本研究中，我们采用蛋白酶消化和微滤技术从双峰驼胎盘中分离出功能性蛋白质（Liu等人，2022）。蛋白质消化过程根据水解程度、抗氧化效果及对细胞外基质成分的保护作用等多方面参数进行优化。随后，我们利用D-半乳糖诱导的细胞和动物衰老模型，检测了所获得的胎盘衍生肽类混合物的抗衰老作用。此外，还通过网络药理学等计算机模拟方法预测可能与抗衰老作用相关的靶点和活性肽。除上述验证外，我们还进行了大量的生化实验、计算机模拟的配体-受体对接及分子动力学建模，以进一步验证我们的假设。同时，还研究了皮肤细胞模型的抗衰老效应，这为基于双峰驼胎盘蛋白肽开发高品质化妆品提供了理论基础。

需要强调的是，传统上“哈利亚苏”是以干粉形式口服使用的，而本研究则采用酶解产物用于外用。这种现代衍生物并非旨在替代传统疗法，而是作为一种实验工具，用于识别可能具有抗皮肤衰老作用的生物活性肽成分。选择酶解法（以获得低分子量肽段）和外用途径（直接作用于皮肤），是基于我们研究的具体目标，即评估其对MMP-1的抑制作用及对胶原蛋白的保护效果，这并不意味着其与传统口服粉末具有同等功效。在民族药理学框架下正确解读本研究时，这一区别至关重要。

化学品与试剂
双峰驼胎盘由新疆新拓乳业公司的新拓骆驼养殖基地提供（中国新疆）。蛋白酶购自北京索拉博生物科技有限公司。SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒和免疫荧光染色试剂盒（货号分别为C0602、P0188）购自上海碧云天生物技术股份有限公司。本研究所使用的各类工具和试剂的详细信息见补充部分。

CBP成分分析
如图1所示，CBP的UPLC-MS/MS总离子色谱图显示，在0至43分钟内存在复杂的多肽谱图。在5至42分钟范围内分布着多个峰，其中在42.41分钟处有一个丰度极高的主峰，而在5.13、10.89、15.70、22.07、31.94和39.51分钟处则有多个中等强度的峰。这一谱图表明，这些多肽为分子量和极性各异的混合体，为后续比较提供了基础数据。

讨论
皮肤衰老是一个由氧化应激、慢性低度炎症、细胞外基质过度降解以及细胞凋亡等多种因素驱动的渐进性病理过程，其中基质金属蛋白酶介导的I型胶原蛋白分解以及caspase-3依赖的成纤维细胞凋亡被视为核心病理事件（Lai等人，2026；Tang等人，2025；Uitto和Bernstein，1998）。来自动物胎盘的天然生物活性肽具有...

结论
总之，本研究表明，双峰驼胎盘酶解产物，尤其是CBPH-Flavourzyme，在体外和体内均具有显著的抗皮肤衰老作用。CBPH-Flavourzyme能有效清除自由基，抑制关键的细胞外基质降解酶，减轻细胞衰老，并促进胶原蛋白合成。在D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型中，它还能增强抗氧化防御能力，增加皮肤厚度，改善胶原纤维的结构。

作者贡献说明
王丹丹：方法学研究。孙泽宇：论文撰写——审阅与编辑。王毅：实验研究、数据整理。秦璐萍：研究指导、资金申请、概念设计。王方远：结果可视化、方法学研究。马青山：论文撰写——审阅与编辑。张巧燕：方法学研究。吴悦：论文初稿撰写、验证、正式分析。林哲源：软件应用、数据整理。徐海荣：结果可视化、方法学研究。张全龙：研究指导、资金申请、概念设计。

未引用参考文献
Chen等人，2024；Chen等人，2025；Li等人，2025；Mode等人，2019；Tong，2019；Wang等人，2025；Wang等人，2026。

知情同意声明
无需。

机构审查委员会声明
浙江医科大学生物伦理委员会已批准与本研究相关的所有实验方案。本研究的设计和方法符合2013年《赫尔辛基宣言》的要求。

利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。

生成式AI使用声明
在撰写本文档时，作者使用了Nano Banana工具来生成可编辑的图形摘要。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审阅和修改，并对最终发表的文章内容承担全部责任。资金来源：本研究得到了新疆维吾尔自治区重点研发计划[项目编号2025B04029]的支持，同时部分资金来自新疆的小型援助团队与灵活专家人才项目。此外，该研究还获得了中央政府引导地方科技发展资金（2025ZY01023）以及浙江中医药现代化重点实验室（2025E10064）的资助。利益冲突声明：? 作者声明不存在任何可能影响本文所述工作的已知财务利益或个人关系。致谢：我们衷心感谢浙江中医药大学中国医学科学院药物研究重点实验室提供的巨大帮助与支持。