代谢功能障碍相关脂肪性肝病中的糖RNA生物合成受损

《Journal of Hepatology》：Impaired glycoRNA biogenesis in metabolic-dysfunction associated steatotic liver disease

　　

程基东|钟晓伟|齐鹏|佐伊·穆勒|尤莉亚·贝姆迪克|卡特琳·斯普利特|琳达·费尔德布吕格|托比亚斯·坎茨|曼文德拉·K·辛格|法尔克·F.R.布特纳|海克·班特尔|海纳·韦德迈尔|迈克尔·奥特|阿莎·巴拉克里希南|阿马尔·迪普·夏尔马

德国汉诺威医学院胃肠病学、肝病学、传染病学与内分泌学系，地址：Carl-Neuberg Str. 1，30625汉诺威

摘要

背景与目的

糖基化蛋白质和脂质可调控多种细胞过程，在器官损伤与再生中起着关键作用。近期发现了糖基化非编码小RNA（glycoRNA），但其在肝脏中的表达及其在肝脏疾病中的作用尚未有相关报道。

方法

我们通过北方印迹法以及一种名为唾液酸适配体与RNA原位杂交介导的邻近连接试验的成像技术来检测glycoRNA的存在，该技术能够直接可视化glycoRNA。此外，我们还利用腺相关病毒载体在体内恢复glycoRNA生物合成的关键介质。

结果

研究表明，glycoRNA可在人类肝脏组织、原代肝细胞以及肝癌细胞中合成。在患有全球最常见的代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的患者组织中，大多数glycoRNA的表达水平下降。从机制上来看，glycoRNA生物合成的两个关键介质——SID1跨膜家族成员1（SIDT1）和含DTW结构域2（DTWD2）的表达降低，是导致MASLD患者体内glycoRNA减少的原因。抑制SIDT1和DTWD2的表达会增加原代人类肝细胞中的脂肪酸负荷，并在与巨噬细胞共培养时加剧炎症反应。重要的是，通过AAV在体内恢复SIDT1和DTWD2的表达，可减轻小鼠的代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）。此外，通过对富集的glycoRNA样本进行测序，我们发现了8种在脂肪性人类肝脏及肝细胞中表达水平下降的glycoRNA。

结论

总体而言，我们的研究证明了glycoRNA存在于人类肝细胞及肝脏组织中，并且在实验性脂肪变性模型以及MASLD患者体内其表达存在异常。

意义与影响

有研究估计，全球有多达24%的人口患有代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）。我们的研究首次表明，这类新近发现的糖基化RNA即glycoRNA存在于肝脏中，且在脂肪肝损伤时其表达会出现异常。更重要的是，在体内恢复glycoRNA的生物合成功能，可减轻MASLD动物模型中的脂肪肝损伤。此外，我们的研究结果还提示，MASLD患者肝脏中的glycoRNA表达存在异常，这为它们作为肝脏损伤的新型生物标志物提供了可能。

引言

最近发现了一类新的糖基化小非编码RNA，被称为glycoRNA。¹这类RNA会以纳米结构的形式存在于细胞表面，与RNA结合蛋白紧密相邻，被认为在细胞外生物学过程，尤其是细胞间相互作用中发挥作用。²glycoRNA由多种小RNA组成，包括小核RNA、小核仁RNA、核糖体RNA、转运RNA以及Y-RNA等，其上还含有经唾液酸化和岩藻糖基化的N-糖链。¹先前的研究已经充分证明了glycoRNA的存在^1,2,3,4，并指出它们在多种生理和病理过程中起着重要作用，比如宿主免疫反应、肿瘤免疫逃逸以及自身免疫性疾病。⁵有关单核细胞与内皮细胞相互作用的研究表明，glycoRNA可能在免疫反应过程中的细胞间交互中起中介作用。⁶此外，glycoRNA还对中性粒细胞的募集至关重要，它们可通过P选择素促进内皮细胞与中性粒细胞之间的识别与交流。⁷更有新的研究证据表明，glycoRNA的脱N-糖基化反应可能会引发强烈的炎症反应。⁸尽管已有这些早期研究结果，但glycoRNA在肝脏疾病中的表达与功能仍需进一步探索。

为研究glycoRNA在肝脏疾病发病机制中的作用，我们选择了脂肪变性与MASH作为研究对象。慢性脂肪性肝病影响着全球近24%的人口。⁹MASH有可能发展为肝硬化，进而增加患肝癌的风险。¹⁰多年来，MASH的治疗一直面临挑战，目前主要依靠药物治疗和生活方式调整，但这些方法对大多数患者来说难以长期坚持。^11,122024年，美国食品药品监督管理局批准了甲状腺激素受体（THR-β）选择性激动剂Resmetirom，这为MASH患者提供了首个治疗选择。^13,14,15该药物主要在肝脏中激活THR-β，从而降低肝内甘油三酯水平，提升肝脏脂肪代谢能力，进而减少肝脏脂肪堆积、脂毒性以及炎症反应。它还有可能逆转炎症和纤维化，因此为MASH的治疗提供了新的途径。¹⁶¹⁷¹⁸

本研究证实，人类肝细胞会表达glycoRNA，而在患有MASH的肝脏中，这类RNA的表达水平会下降。我们还发现，当游离脂肪酸含量过高时，参与glycoRNA生物合成的关键酶活性会被抑制，进而导致肝细胞中的脂肪含量进一步上升。通过对比患有MASH与未患该病的肝脏中富集的glycoRNA样本并对其进行测序，我们找到了8种在MASH患者肝脏中表达水平下降的glycoRNA。此外，抑制glycoRNA的生物合成还会增强巨噬细胞中的促炎信号。

章节要点

glycoRNA的分离与检测

首先将总RNA与2倍浓度的RNA结合缓冲液以及3倍浓度的100%乙醇混合，然后使用Zymo RNA Clean & Concentrator Kit（Zymo Research公司产品）对混合液进行纯化。随后将符合质量要求的40微克总RNA进行氧化处理。接着，将这些样本与1单位的半乳糖氧化酶（Worthington公司产品）以及辣根过氧化物酶（Sigma公司产品）一起，置于含有20% DMSO的85微升无核酸酶水中，在25°C下孵育2小时。这一步骤能够特异性地检测出含有半乳糖或N-乙酰半乳糖胺的glycoRNA。

原代人类肝细胞也表达glycoRNA

我们首先探讨了原代人类肝细胞是否表达glycoRNA。为了检测这些RNA，我们使用了一种灵敏度极高且具有高度选择性的成像技术，即唾液酸适配体与RNA原位杂交介导的邻近连接试验（ARPLA）。^6,20该技术包括四个关键步骤：双重识别、连接器杂交、邻近连接以及滚环扩增。通过该技术，我们成功在原代人类肝细胞以及人类肝癌细胞系Huh7和HepG2中检测到了glycoRNA的存在。

讨论

总体而言，本研究取得了多项重要发现。首先，我们证实了原代人类肝细胞以及人类肝癌细胞中都存在glycoRNA。其次，我们在MASH小鼠模型中发现了参与glycoRNA生物合成的酶类表达异常，这一结果与我们之前的体外实验结果一致，即在游离脂肪酸诱导脂肪变性后，glycoRNA的表达水平会下降。更为重要的是，在体内过表达SIDT1和DTWD2可以减轻两种临床前小鼠模型中的MASH症状。

未引用参考文献

19.; 20..

数据可用性声明

作者声明，支持本研究结果的所有数据均保存在论文正文及其补充材料文件中，可供查阅。

作者贡献

ADS和AB提出了研究思路，设计了研究方案，并为整个研究确立了概念框架。C-JD在XZ、QP和ZM的帮助下完成了所有实验工作。HW和HB提供了来自生物样本库的人类生物材料。MO和MKS为动物实验提供了支持。KS和LF提供了原代人类肝细胞。JB和FB负责糖链分析工作。MO和TC则从概念层面对项目和论文进行了评估。最终，C-JD、AB、MO和ADS共同完成了论文的撰写工作。

资金支持

本研究得到了勃林格殷格翰基金会的Rise Up计划以及德国研究基金会的资助，相关资助分别授予了阿马尔·迪普·夏尔马，资助项目包括DFG的SH640/6-1号项目以及DFG的海森堡计划SH640/8-1号项目。

利益冲突声明

作者声明，本人不存在与本研究相关的任何利益冲突。

致谢

我们要感谢波士顿儿童医院的瑞安·弗林教授，他针对我们的研究数据提出了宝贵的意见，帮助我们提升了研究的质量。同时，我们也十分感激莱斯大学的马远教授以及马克斯·普朗克感染生物学研究所的郭伟杰博士，他们对我们所使用的ARPLA技术给予了大力支持。此外，我们还要感谢苏州大学的李佳佳博士，他对SPCgRNA方法的发展提供了帮助。