《Nature Communications》：Induced pluripotent stem cell–derived models of malignant nerve sheath tumor progression mimic glial to neuro-mesenchymal transition and uncover therapeutic opportunities
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研究人员利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经嵴（NC）模型，通过基因编辑重现神经纤维瘤病1型（NF1）相关外周神经肿瘤的恶性转化过程。NF1-CDKN2A双敲除（2KO）NC细胞在体内形成神经纤维瘤样肿瘤，该过程需要p14ARF和p16INK4a的失活。附
研究人员利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经嵴（NC）模型，通过基因编辑重现神经纤维瘤病1型（NF1）相关外周神经肿瘤的恶性转化过程。NF1-CDKN2A双敲除（2KO）NC细胞在体内形成神经纤维瘤样肿瘤，该过程需要p14ARF和p16INK4a的失活。附加的PRC2（polycomb repressive complex 2，多梳抑制复合体2）缺失（3KO）破坏多能性并诱导间充质干细胞样特征。3KO NC细胞经历全局染色质重组，通过SOX10沉默阻止胶质细胞发生，并激活神经-间充质转录程序，重现PNF-ANNUBP-MPNST进展过程。神经移植后，3KO NC球体在体内形成MPNST样肿瘤，模拟早期MPNST。此外，研究人员利用3D NC球体模型通过高通量筛选表观遗传化合物发现靶向MPNST的药物。聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂（PARPi）在PRC2缺陷NC球体中表现出选择性疗效，且Olaparib-Selumetinib联合用药在人源MPNST患者来源异种移植（PDX）小鼠模型中耐受性良好并显著抑制肿瘤生长。
恶性外周神经鞘瘤（MPNST）是起源于外周神经细胞的侵袭性软组织肉瘤，近半数病例与神经纤维瘤病1型（NF1）相关。NF1患者一生中发展MPNST的风险高达10-15%，使其成为该病患者的主要死因，五年生存率极低，目前除及时手术外缺乏有效治疗手段。MPNST的发生通常遵循肿瘤抑制基因（TSG）序贯失活的模式：NF1失活导致良性丛状神经纤维瘤（PNF）形成，CDKN2A完全缺失标志着前恶性病变ANNUBP的出现，而PRC2功能丧失则驱动肿瘤向恶性MPNST转化，伴随细胞身份从胶质细胞向间充质细胞的转变。尽管已有多种体外和体内模型用于研究NF1相关肿瘤，但能够模拟从良性到恶性进展过程的模型仍然匮乏，且既往高通量筛选（HTS）主要依赖二维培养体系，难以充分反映肿瘤生物学特征。
研究人员在《Nature Communications》发表的研究工作中，建立了基于人iPSC来源NC的模型平台，通过序贯失活NF1、CDKN2A和SUZ12来重现PNF-MPNST进展的遗传事件。该平台捕获了神经纤维瘤向MPNST转化的胶质-间充质转变特征，三敲除（3KO）NC球体在神经移植后能够形成早期MPNST样肿瘤。利用此平台，研究人员开展了表观遗传化合物库的高通量筛选，鉴定出PARP抑制剂（PARPi）在PRC2缺陷模型中具有选择性活性，且PARPi与MEK抑制剂（MEKi）联合用药在人源MPNST异种移植模型中显著抑制肿瘤生长，为MPNST治疗提供了新的策略方向。
研究主要采用以下关键技术方法：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在人iPSC中建立NF1、CDKN2A（含p14ARF和p16INK4a可变编辑）及SUZ12的序贯敲除模型；通过定向分化获得NC及施万细胞（SC）、间充质干细胞（MSC）谱系细胞；采用全基因组测序（WGS）、RNA测序（RNA-seq）、染色质开放性分析（ATAC-seq）及DNA甲基化芯片（EPIC array）进行多组学整合分析；构建3D球体培养体系用于高通量药物筛选（qHTS），采用NCATS NPACT表观遗传化合物库进行单药及联合用药筛选；利用裸小鼠坐骨神经移植模型进行体内致瘤性验证，并在人源MPNST PDX模型（NF1-18B）中开展Olaparib联合给药的治疗性研究。
NF1(-/-) CDKN2A(-/-)神经纤维瘤球体体内形成需要p14ARF失活。研究人员在NF1缺失iPSC（1KO）基础上靶向编辑CDKN2A基因，分别获得p16单缺失（2KO p16）和p14p16双缺失（2KO p14p16）细胞系。NC分化后，2KO p16和2KO p14p16细胞均可形成神经纤维瘤球体，并与PNF来源成纤维细胞共培养后进行裸小鼠坐骨神经移植。结果显示，2KO p14p16细胞在15次注射中形成9个肿瘤，而2KO p16细胞仅3次形成肿瘤且体积显著较小，表明野生型p14ARF功能损害神经纤维瘤的 proper 形成。
2KO NC对胸苷酸合酶抑制敏感。通过转录组分析比较1KO与2KO p14p16细胞，结合患者肿瘤RNA-seq数据，发现TYMS基因在2KO细胞和ANNUBP中共同高表达。研究人员使用胸苷酸合酶（TS）抑制剂Pemetrexed处理2KO NC细胞，观察到其对TS抑制更为敏感，出现细胞体积增大、核异常及胞质扩张等形态学改变。
NF1、CDKN2A和PRC2在iPSC中的失活存在生物学上的顺序约束。研究人员尝试在1KO、2KO p16和2KO p14p16三种基因型iPSC中进一步敲除SUZ12（PRC2核心组分）。结果发现，仅能在2KO p14p16背景中成功建立并扩增SUZ12敲除克隆（即3KO），而在保留p14ARF功能的1KO和2KO p16细胞中无法维持PRC2缺失克隆。 VS 通过多西环素诱导性p14或p16重表达实验证实，p16或p14的重新表达在3KO细胞中均严重损害细胞活力，支持PRC2的失活必须发生在CDKN2A完全失活之后。
PRC2缺失诱导多能性丧失、间充质身份获得，并可在NC条件下维持。SUZ12编辑的2KO p14p16 iPSC在iPSC培养条件下自发分化为间充质样表型，表达MSC标志物CD73、CD13、CD44，但无法持续增殖。研究人员将培养条件转换为NC诱导体系后，成功建立3KO NC细胞系，该细胞系保留NC标志物p75和Hnk1表达，但SOX10表达完全丧失，SOX9表达显著上调，同时伴随胶质基因（SOX10、NGFR、PLP1）下调和间充质基因（SOX9、TWIST1、PRRX1）上调。
3KO NC球体在神经移植后产生人源MPNST样肿瘤。将3KO NC样球体移植至裸小鼠坐骨神经，4个月后形成高细胞密度、多核分裂象的肿瘤，组织学符合MPNST特征，Ku-80染色确认人源来源。与1KO/2KO形成的神经纤维瘤样肿瘤相比，3KO肿瘤缺失H3K27me Universal 和SOX10/S100B表达，但Vimentin和Ki67阳性，呈现更高的增殖活性。
MPNST细胞身份深受PRC2失活和MSC样特征影响。通过比较3KO NC与 Established MPNST细胞系的转录组、甲基化组和染色质开放性，PCA分析显示PRC2缺失和MSC身份对MPNST细胞身份界定有深远影响。差异表达基因聚类分析识别出3KO NC与MPNST细胞系共同上调的神经发生相关基因（Cluster N1）、在MSC和MPNST中表达的心肌愈伤相关基因（Cluster M），以及仅在MPNST中高表达的另一组神经发生基因（Cluster N2）。ATAC-seq数据证实，PRC2缺失导致神经发生基因染色质开放和胶质发生基因染色质关闭。
3KO NC重现胶质-间充质转化：胶质发生受损与神经-间充质基因表达。SC分化实验显示3KO NC无法表达SOX10及任何SC标志物，SOX10启动子呈闭合染色质构象，而SOX9启动子保持开放。整合分析表明，Cluster N1神经发生基因在PRC2缺失后直接因染色质开放而表达；Cluster M愈伤基因需要间充质因子才能表达；Cluster N2神经发生基因则需要PRC2缺失和间充质因子之外的额外未知因素。
鉴定的人类NF1相关肿瘤中的胶质-神经-间充质转化特征。利用原代PNF来源SC、PNF、ANNUBP和MPNST的批量及单细胞RNA-seq数据验证，神经-间充质特征基因（PCSK1、PLEC、PPARG、SOX9、TWIST1、PRRX1）特异性表达于MPNST的间充质细胞成分，而胶质发生基因SOX10、NGFR、PLP1局限于各组织的胶质成分。
表观遗传调节剂高通量筛选鉴定候选化合物及与MEK抑制的协同作用。使用339种化合物的NPACT表观遗传库对1KO、2KO、3KO及3KO+（杂合TP53）NC球体进行qHTS，发现BET抑制剂（BETi）在1KO/2KO中活性更高，而PARPi对PRC2缺陷球体有选择性杀伤作用。联合用药筛选中，Selumetinib（MEKi）与PARPi、HDACi或BETi的组合在3KO NC球体中显示出协同效应，但PARPi联合效应主要限于3KO NC模型，对MPNST细胞系效果有限。
人源MPNST PDOX的初步体内研究鉴定Olaparib联合方案为潜在治疗策略。在NF1-18B MPNST PDX模型中，Olaparib单药无显著抗肿瘤活性；Olaparib/I-BET151、Olaparib/Ribociclib和Olaparib/Selumetinib双联治疗分别实现30.6%、36.5%和61.6%的相对肿瘤体积减少，其中Olaparib/Selumetinib效果最显著且耐受性良好，接近三联MEKi-CDKi-BETi方案的疗效。Western blot证实各药物靶点的有效 Engagement 及下游通路抑制。
该研究通过建立iPSC来源的NC模型平台，系统阐明NF1相关外周神经肿瘤从良性向恶性进展的分子机制，特别是PRC2缺失驱动的胶质-神经-间充质转化过程。3KO NC模型不仅在表观基因组和转录组层面重现了MPNST的细胞身份特征，更在体内形成早期MPNST样肿瘤，为研究肿瘤起始机制提供了可追踪的系统。基于该模型的HTS平台成功鉴定出PARPi作为PRC2缺陷肿瘤的潜在靶向药物，且PARPi-MEKi联合方案在PDX模型中显示出显著疗效，为临床治疗MPNST提供了新的组合策略选择。该研究凸显了利用发育谱系特异性细胞模型进行肿瘤生物学研究和药物发现的重要价值。
