BNIP3反向工程鉴定出一种线粒体保护性肽（mitochondrial protective peptide）

《Nature Communications》：Reverse engineering of BNIP3 identifies a mitochondrial protective peptide

　　

摘要：近期线粒体网络动态及信号传导研究的进展凸显了线粒体作为多种疾病关键治疗靶点的地位。然而，药物研发的高失败率反映出人们对调控线粒体命运上游分子机制的理解尚不完善。本研究通过对BH3-only蛋白BNIP3（BCL-2/adenovirus E1B 19-kDa interacting protein 3）进行反向工程来解决这一空白。通过对BNIP3 N端进行结构建模及序列-功能分析，鉴定出一个关键功能域及可直接激活BCL-2家族执行蛋白（executioner proteins，即BAX和BAK1）并触发线粒体细胞死亡的氨基酸热点（hotspots）。基于上述发现，研究人员开发了BNIP3拮抗肽B-017，其可阻断BNIP3与BCL-2执行蛋白间的相互作用，维持线粒体完整性。B-017表现出靶点特异性、良好的安全性及对人类细胞中死亡信号的有效抑制。在临床相关动物模型中，B-017减轻了心脏、脑及肝脏的组织损伤。上述结果表明B-017是靶向线粒体功能障碍（mitochondrial dysfunction）的有前景的治疗候选分子。

论文解读：

《Reverse engineering of BNIP3 identifies a mitochondrial protective peptide》一文发表于《Nature Communications》。目前多种疾病与程序性细胞死亡过度激活密切相关，尽管内在凋亡途径和线粒体通透性转换（mPT）驱动的坏死途径已被较为充分地认知，但直接针对凋亡晚期caspase或mPT孔（mPTP）的临床试验均告失败，原因可能是线粒体已发生不可逆损伤。因此，靶向影响线粒体命运的BCL-2家族上游事件成为潜在策略。BNIP3是一种非典型BH3-only蛋白，可通过BAX（BCL-2-associated X protein）和BAK1（BCL-2 antagonist/killer 1）诱导线粒体损伤及凋亡与坏死，是同时阻断两种死亡通路的理想靶点。然而BNIP3与BAX/BAK1相互作用的关键结构域及激活机制尚未明确。本研究通过对BNIP3进行反向工程——结合细胞生物学、结构建模、肽微阵列筛选及动物模型验证——鉴定BNIP3 N端激活BAX的关键功能域与氨基酸热点，并据此设计合成了BNIP3拮抗肽B-017（TAT-WVELHFFN），证实其通过竞争性结合BNIP3和BAX阻止BAX活化及插入线粒体外膜，从而在细胞及多种缺血再灌注（I/R）动物模型中保护线粒体功能、减少梗死面积。

主要关键技术方法：①建立Bax^?/?、Bak^?/?、Bnip3^?/?及Bnip3-3xFlag敲入（knock-in）小鼠模型及对应原代细胞；②采用Modeller算法以BAX（PDB 2K7W）为模板构建BNIP3同源模型并经圆二色谱（CD）及化学交联-质谱（DSSO-XL-MS）验证；③HDOCK和HADDOCK进行BNIP3/BAX及肽段对接模拟；④固相合成肽段文库微阵列筛选BNIP3 N端截短及单位点突变结合热点；⑤荧光各向异性（fluorescence anisotropy）与微量热涌（MST）测定肽-蛋白解离常数（K_D）；⑥光交联-质谱（BpA-XL-MS）定位B-017与BAX/BNIP3结合界面；⑦小鼠、猪及大鼠缺血再灌注（心肌I/R、脑tMCAO、离体肝保存再灌注）模型评价体内药效；⑧LC-MS/MS代谢组学分析再灌注后心肌代谢物变化。

Rationale for structure-based BNIP3 antagonist peptide design

研究人员通过原位邻近连接实验（PLA）证实BNIP3与BAX/BAK1在基础条件下即存在紧密接近，且依赖BAX的存在，BNIP3不与抗凋亡BCL-2直接靠近。重组蛋白共免疫沉淀验证了BNIP3-BAX相互作用，且该复合物中BAX处于非活化状态。肽微阵列显示BNIP3与BAX的α5、α6、α7/α8螺旋区潜在结合。以BAX为模板构建并经CD及DSSO-XL-MS验证的BNIP3同源模型进行HDOCK对接，预测BNIP3 N端Trp-13、Val-14、Leu-16、His-17与BAX α5螺旋形成主要疏水相互作用并由Glu-15-Arg-78氢键稳定，BNIP3与BAK1未获有利对接构象，故聚焦BNIP3 N端-BAX界面。

Development of BNIP3 peptide from the identified activation domain

DeepFRI及PredictProtein预测BNIP3 N端前50残基具蛋白结合功能。合成BNIP3-peptide_1–49可在体外诱导BAX构象改变（6A7表位暴露）及BAX插膜（碱提取实验），证实N端具BAX激活功能。截断与单位点替换肽微阵列筛选确定BNIP3_13–20（WVELHFSN）为最强结合片段，其中W13和F18为关键芳香残基，S19F替换增强亲和力。最终选定WVELHFFN融合HIV-1 TAT穿膜域（PTD_48–59）构成B-017（TAT-WVELHFFN），荧光各向异性测得B-017与hBAX K_D=303 nM，与hBNIP3 K_D=700 nM。AlphaFold2建模及BpA光交联-质谱定位B-017结合于BAX α1-α2 loop与α5螺旋间口袋（交联至BAX M38、L70及BNIP3 T140）。

Signalling profile of the BNIP3 antagonist peptide B-017

B-017处理可减少星形孢菌素（STS）诱导的BAX插膜；体外抑制BAX 6A7表位暴露（第一步活化）及α9螺旋暴露与插膜（第二步活化）。在Bax^?/?、Bak^?/?、Bcl-2^?/?MEFs中，B-017降低caspase 3/7活化及STS诱导死细胞丢失，表明B-017主要通过干扰BNIP3-BAX相互作用抑制BAX/BAK1介导的死亡信号。

B-017 inhibits apoptotic and necrotic signalling pathways in human cells

B-017在HEK293、人心脏成纤维细胞（HCF）、MCF-7、人原代心肌细胞（HCM）及iPSC来源心肌细胞中维持细胞贴附，抑制caspase 3/7活化、活性氧（ROS）生成、线粒体Ca²⁺超载、mPTP开放及线粒体膜电位（ΔΨ_mito）去极化，对对照TAT肽无响应，证明B-017可同时拮抗多种刺激诱发的凋亡与坏死信号。

B-017 possess cytoprotective properties in clinically relevant models

B-017与BAX结合亲和力高于抗凋亡BCL-2（K_D≈1.3 μM）及MCL-1，不结合GST，大鼠14天重复给药未见全身毒性及脏器损伤，支持其治疗潜力。小鼠心肌I/R（30 min缺血/24 h再灌注）中B-017于心腔注射使梗死面积较对照组减少约40％且呈剂量依赖性；猪闭胸I/R（60 min缺血/4 h再灌注）静脉推注0.075 mg/kg B-017使梗死面积减少约60％。B-017处理小鼠在再灌注后左室射血分数（LVEF）及整体径向应变（GRS）恢复优于对照。小鼠短暂大脑中动脉闭塞（tMCAO）静脉给予B-017使脑梗死体积减少52％、改善神经评分；大鼠离体肝冷保存再灌注模型中B-017冲洗减少ALT/AST释放并提高胆汁分泌。Bnip3^?/?小鼠基础梗死减小且B-017无附加保护，证实B-017作用依赖于BNIP3-BAX轴。再灌注心肌中B-017减少线粒体肿胀、血清cTnI、线粒体积聚BAX、胞质细胞色素c释放及caspase活化，伴随TCA循环中间产物（琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、α-酮戊二酸）及脯氨酸、丝氨酸升高及ATP水平恢复。

Discussion

研究人员通过BNIP3反向工程阐明BNIP3 N端W¹³VELHFFN²⁰基序通过与BAX α5及α1-α2 loop结合直接激活BAX，并基于此设计细胞穿透性BNIP3拮抗肽B-017。B-017竞争性结合BNIP3和BAX，阻止BAX构象改变及线粒体外膜插入，从而同时抑制BAX/BAK1介导的凋亡与坏死通路。在小鼠、猪I/R模型及小鼠脑、肝I/R模型中B-017减小梗死/损伤并改善功能，且具靶点特异性与良好安全性。研究表明BNIP3-BAX/BAK1轴是抑制线粒体依赖性细胞死亡的关键节点，B-017为该轴的高效调节剂及靶向线粒体功能障碍的潜在治疗药物。