15-脂氧合酶(15-LOX)对醚型(烯基)-二十碳四烯酰基-磷脂酰乙醇胺(ether-(alkenyl)-ETE-PE)氧化的催化偏向性赋予促铁死亡(pro-ferroptotic)细胞死亡信号的选择性

《Nature Communications》：15-LOX-catalytic bias towards ether-(alkenyl)-ETE-PEs oxidation bestows selectivity of PRO-ferroptotic cell death signaling

　　

摘要：醚型(烷基/烯基)磷脂特别是磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱(PC)广泛存在于生物膜中，但其生理功能尚不清楚。缩醛磷脂(plasmalogens)通过氧化sn-1位乙烯键(vinyl bond)发挥抗氧化作用的观点曾被认为与其抗铁死亡调节功能相关；反之，烯基-PE(alkenyl-PE)sn-2位多不饱和脂肪酸(PUFA)残基的过氧化可促发铁死亡(ferroptosis)。由于15-脂氧合酶(15-LOXs)生成15-HpETE-PE作为铁死亡信号，研究人员探究了烷基/烯基-ETE-PE(即sn-2位含花生四烯酸/二十碳四烯酸arachidonoyl, ETE的PE)作为酶促过氧化底物的特性。通过氧化还原脂质组学(redox lipidomics)、生化、生物物理、遗传学方法及分子动力学模拟，研究人员证实15-LOX两种亚型(15-LOX-1和15-LOX-2)均选择性氧化烷基/烯基-ETE-PE(而非烷基/烯基-ETE-PC)，生成15-HpETE-PE并触发铁死亡，且该过程独立于sn-1位乙烯键的氧化。研究人员发现LOX催化的sn-1位乙烯键过氧化速率约为sn-2位ETE-PE过氧化的1/500，从而排除缩醛磷脂抗氧化作用在铁死亡中的意义。研究人员证实15-LOX驱动生成的sn-1-烯基-sn-2-15-HpETE-PE在急性/慢性疾病(哮喘、癌症、脑外伤、皮肤UVB损伤)中起致病作用。因此，15-LOX对烯基-ETE-PE氧化的催化偏向性可能代表新的治疗靶点。

论文解读：《Nature Communications》发表——15-LOX-catalytic bias towards ether-(alkenyl)-ETE-PEs oxidation bestows selectivity of PRO-ferroptotic cell death signaling

一、研究背景与立项依据

缩醛磷脂(plasmalogens，即sn-1位含烯基醚键alkenyl ether的醚磷脂ether phospholipids)在哺乳动物细胞膜中大量存在，传统观点认为其sn-1位乙烯键可被氧化而发挥"牺牲性抗氧化"作用从而抑制脂质过氧化和铁死亡。然而近年遗传研究表明醚磷脂缺失反而增加细胞铁死亡敏感性，且sn-2位富集的多不饱和脂肪酸(PUFA, 如花生四烯酸/二十碳四烯酸ETE/arachidonic acid, AA)才是铁死亡的关键底物。15-脂氧合酶(15-lipoxygenase, 15-LOX-1和15-LOX-2)可酶促sn-2-ETE-PE生成15-氢过氧-ETE-PE(15-HpETE-PE)，是铁死亡启动的核心事件，但15-LOX对不同类型ETE-PE(二酰基diacyl-PE vs 烯基醚alkenyl-PE)及不同头基(PE vs PC)的底物偏好及其在铁死亡中的意义不明，缩醛磷脂sn-1乙烯键抗氧化假说也缺乏活体证据。本研究旨在明确15-LOX对醚型ETE-PE的催化选择性、sn-1与sn-2氧化竞争关系，及其在铁死亡和相关疾病中的作用。

二、主要关键技术方法

研究人员综合运用了以下核心技术：①氧化还原脂质组学(redox lipidomics)结合LC-ESI-MS/MS定量组织/细胞中二酰基与烯基ETE-PE、ETE-PC及其氢过氧/羟基衍生物；②体外酶促过氧化体系（脂质体模型）评估15-LOX-1/15-LOX-2对不同底物的氧化速率；③电子自旋共振(Electron Spin Resonance, ESR)检测酶促脂质过氧自由基生成；④全原子分子动力学(Molecular Dynamics, MD)模拟及分子对接解析15-LOX-2与alkenyl-ETE-PE/PC及PEBP1复合物的相互作用；⑤细胞模型（A375黑色素瘤GPX4^-/-及WT细胞、HAEC人气道上皮细胞、HEK人表皮角质形成细胞、HT22海马神经元等）进行基因敲降(knockdown, KD)——包括AGPS(烷基甘油磷酸合成酶，醚脂合成关键酶)、TMEM189(缩醛磷脂去饱和酶，引入sn-1乙烯键)、TMEM164(烯基-sn-2-ETE-PE酰基转移酶)、15-LOX-1/15-LOX-2、PEBP1(磷脂酰乙醇胺结合蛋白1)；⑥动物/组织模型——小鼠可控皮质撞击(Controlled Cortical Impact, CCI)脑外伤模型、Lewis肺癌(LLC)荷瘤Alox12/15^flCre^+/?小鼠分离PMN-MDSC(多形核髓源性抑制细胞)、人支气管上皮(HAEC)原代培养（健康者及轻/重度哮喘患者）、人表皮植片(HEE)UVB照射模型；⑦基质辅助激光解吸电离质谱成像(MALDI-MSI)及离子淌度分离(timsON)区分等压脂质物种。

三、研究结果

Abundance and distribution of polyunsaturated diacyl- and alkenyl-phospholipids in cells and tissues（细胞与组织中多不饱和二酰基及烯基磷脂的分布与丰度）

通过脂质组学分析多种小鼠组织、人表皮植片及细胞系(HAEC、HBE、HT22、A375等)和各细胞器(胞质、线粒体、质膜)，研究人员发现ETE含烯基-PE(alkenyl-ETE-PE)是大多数组织和细胞质膜内层最主要的可过氧化ETE-PE物种，含量显著高于相应二酰基ETE-PE(diacyl-ETE-PE)；而ETE-PC以二酰基为主。烯基-ETE-PE在HAEC细胞质膜显著富集，表明其为潜在的生理重要底物。

15-LOX catalyzes selective oxidation of diacyl-ETE- and alkenyl-ETE-phospholipids in biochemical models（15-LOX在生化模型中催化二酰基-ETE-与烯基-ETE-磷脂的选择性氧化）

体外脂质体体系中，15-LOX-1和15-LOX-2均高效氧化alkenyl-S-ETE-PE生成15-HpETE-PE和15-HETE-PE，速率约为diacyl-S-ETE-PE的~5倍；对alkenyl-S-ETE-PC和diacyl-S-ETE-PC氧化极慢。HT22细胞天然脂质制备的脂质体中alkenyl-S-ETE-PE氧化仍显著快于diacyl-S-ETE-PE。非酶促自由基引发剂AMVN则无此选择性。sn-2位ETE过氧化速率比sn-1位乙烯键氧化快约500倍，排除sn-1乙烯键"抗氧化牺牲"在15-LOX介导铁死亡中的意义。ESR显示alkenyl-S-ETE-PE存在时抗坏血酰自由基信号更强且衰减更快，证实其为更优底物。

Molecular dynamics simulations of 15-LOX interactions with alkenyl-S-ETE-PE vs alkenyl-S-ETE-PC（15-LOX与alkenyl-S-ETE-PE及alkenyl-S-ETE-PC相互作用的分子动力学模拟）

MD模拟显示alkenyl-S-ETE-PE的sn-2链稳定结合15-LOX-2催化口袋活性中心疏水残基(L420/L610/L415/L374/F184/V419/L373及催化His373)，维持可过氧化构象；而alkenyl-S-ETE-PC的sn-2链无法稳定驻留催化位点，迅速脱离至酶表面入口处。这从结构水平解释了15-LOX对PE头基(而非PC头基)及烯基醚骨架的偏好。

MD simulations demonstrate that PEBP1 binding has no significant effect on the interaction of alkenyl-ETE-PE with 15-LOX-2（MD模拟表明PEBP1结合对alkenyl-ETE-PE与15-LOX-2相互作用无显著影响）

已知PEBP1增强15-LOX对diacyl-S-ETE-PE的氧化(通过阻止sn-1酯链进入催化位点)，但MD模拟和实验均显示PEBP1缺失不影响15-LOX对alkenyl-S-ETE-PE的氧化——alkenyl-PE的sn-1位为乙烯醚键(无极性酯连接)，不与PEBP1相互作用，sn-2链自行稳定结合催化位点，故PEBP1非必需。

Exogenous 15-LOX-2/alkenyl-ETE-PE induces ferroptosis in A375 cells（外源15-LOX-2/alkenyl-ETE-PE诱导A375细胞铁死亡）

共孵育外源15-LOX-2与alkenyl-S-ETE-PE或diacyl-S-ETE-PE均可诱导WT及GPX4^-/-A375细胞铁死亡，且alkenyl-S-ETE-PE效力更强；ETE-PC类无诱导作用。纯化的alkenyl-S-15-HpETE-PE本身即可致死，证实产物是直接促死信号。

Oxidation of sn-1-vinyl group of plasmalogens does not affect sensitivity of cells to ferroptosis（缩醛磷脂sn-1乙烯键氧化不影响细胞铁死亡敏感性）

KD AGPS(消除所有醚/烯基磷脂)或KD TMEM189(消除sn-1乙烯键保留烷基/烯基链)均不改变RSL3诱导的铁死亡敏感性；而sn-2位脂肪酸置换(油酸抑制、ETE促进)显著改变敏感性，证实决定铁死亡敏感性的是sn-2-ETE而非sn-1乙烯键。

Oxidation of sn-2-ETE plasmalogens strongly affects sensitivity of cells to ferroptosis（sn-2-ETE缩醛磷脂的氧化强烈影响细胞铁死亡敏感性）

KD TMEM164(负责将ETE从diacyl-ETE-PC转移至alkenyl-lysophospholipid生成alkenyl-sn-2-ETE-PE)降低细胞内alkenyl-ETE-PE/diacyl-ETE-PC比值并使细胞抵抗RSL3诱导的铁死亡。ACSL4(长链脂酰CoA合成酶4，PUFA活化关键酶)KO使diacyl-与alkenyl-S-ETE-PE均下降且RSL3处理后无15-HpETE-PE积累，证实sn-2-ETE-PE(含烯基型)丰度决定铁死亡易感性。

Endogenous 15-LOX accelerates oxidation and consumption of alkenyl-PE in HAECs（内源15-LOX加速HAEC中烯基-PE的氧化与消耗）

IL-13诱导HAEC表达15-LOX-1并使细胞对RSL3敏感化；ETE孵育增加alkenyl-ETE-PE，IL-13进一步促其氧化为alkenyl-S-HpETE-PE。15-LOX-1主要定位于胞质，alkenyl-S-HpETE-PE在胞质高于线粒体。15-LOX-1 KD降低alkenyl-/diacyl-S-HpETE-PE生成并减弱RSL3致死率。

Role of 15-LOXs in oxidation of alkenyl-PEs in disease conditions（15-LOX在疾病状态下烯基-PE氧化中的作用）

①脑外伤：机械牵张HT22神经元及小鼠CCI模型中15-LOX-2上调，牵张/损伤后alkenyl-HETE-PE积累高于diacyl-HETE-PE(依赖15-LOX-2)，15-LOX-2 KD或baicalein(黄芩素，15-LOX抑制剂)减轻过氧化与损伤。②肿瘤免疫：LLC荷瘤Alox12/15^flCre⁺(LOX缺陷)PMN-MDSC中alkenyl-S-HpETE-PE低于Cre^?，且对RSL3敏感性低。③哮喘：人严重哮喘患者HAEC中15-LOX-1表达及alkenyl-S-HpETE-PE(非diacyl型)高于健康对照，且与FeNO(呼出气一氧化氮，fractional exhaled nitric oxide)正相关。

四、讨论与结论总结

研究人员在讨论中指出：①醚磷脂尤其是缩醛磷脂sn-2位富集PUFA-PE是铁死亡的关键底物，哺乳动物中alkenyl-ETE-PE是15-LOX最优先的底物之一，其sn-2过氧化速率比sn-1乙烯键快~500倍，不支持缩醛磷脂通过sn-1氧化发挥"抗氧化"调控铁死亡启动的观点——所谓抗氧化作用可能是体外非酶体系的假象。②15-LOX对alkenyl-ETE-PE的高亲和源于其sn-1烯基醚使分子在酶催化口袋中采取有利取向且不干扰sn-2链结合，无需PEBP1辅助(不同于diacyl-ETE-PE)。③alkenyl-ETE-PE经15-LOX生成15-HpETE-PE既是铁死亡启动信号也在炎性疾病(哮喘)、神经创伤(TBI)、皮肤UVB损伤、肿瘤免疫抑制微环境中作为病理介质。④TMEM164是唯一已知具ETE选择性的缩醛磷脂重塑酶，决定alkenyl-sn-2-ETE-PE池大小从而影响铁死亡阈值。

最终结论（翻译研究结论部分）： 铁死亡脂质过氧化受多不饱和底物可用性及特定磷脂类别(尤PUFA-PE)调控。其中PUFA-PE缩醛磷脂因15-LOX对其sn-2链的更高效酶促过氧化而成为优选底物。尽管缩醛磷脂sn-1乙烯键可被15-LOX氧化，但该反应效率较sn-2-ETE-PE过氧化低两个数量级以上，故缩醛磷脂所谓"抗氧化"功能不作为15-LOX驱动铁死亡调控机制。由缩醛磷脂sn-2-PUFA前体酶促生成氢过氧-PUFA-PE可能是炎性脂质介质合成的替代通路——PE缩醛磷脂充当磷脂过氧化的选择性储库及脂质介质合成前体库，赋予了这类长期未被阐明功能的脂质新的生物学意义。15-LOX对醚型ETE-PE的催化偏向性是铁死亡选择性的分子基础，可作为多疾病干预的新靶点。